酸奶中乳酸菌的分离与纯化

酸奶中乳酸菌的分离与纯化一、实验目的1.掌握分离乳酸菌的基本原理和操作技术；2.学习并掌握稀释法和微生物纯培养操作。二、实验设备及材料培养基材料：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、番茄汁、葡萄糖、吐温、溴甲酚绿、琼脂。实验材料：无菌水、培养皿、电热套、高压蒸汽灭菌锅、电子分析天平、涂布棒、酒精灯、无菌试管、移液枪、无菌吸管。三、实验原理乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。大多数不运动，少数以周毛运动。菌体常排列成链。根据细胞形态分为球状或杆状，可分为两大类，即乳酸链球菌和乳酸杆菌。在乳酸菌培养基平板上，乳酸菌菌落大约1～3mm，圆形隆起，表面光滑，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸周围还能产生CaCO3溶解圈。乳酸菌革兰氏染色后呈蓝色，为革兰氏阳性菌。四、实验步骤1.乳酸菌培养基的制作配方牛肉膏2.0g蛋白胨2.0g酵母膏2.0g番茄汁40g葡萄糖2.0g吐温0.10mL碳酸钙3.4g溴甲酚绿0.02g琼脂2～4g水200mL①称量：按照培养基配方依次称取药品放入烧杯中。②熔化：在烧杯中加入略少于200mL水，加热至沸腾。依次加入药品，用玻璃棒不断搅拌，待其完全溶解后，加入琼脂，搅拌至完全熔化，最后补足所损失的水分。③分装：将配置的乳酸菌培养基装入三角瓶中。④加棉塞、包扎⑤灭菌：将乳酸菌培养基在压力0.11MPa，温度121℃条件下灭菌20min。⑥无菌检查2.倒平板将乳酸菌培养基熔化，待冷却至55～60℃时，倒平板，倒好后，在室温下培养2～3d，或37℃培养24h，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。3.制备稀释液量取酸奶10mL，放入盛有90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，震摇约20min，使酸奶与无菌水充分混合，将酸奶分散。用一只1mL无菌吸管从中吸取1mL酸奶悬浊液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1mL无菌吸管从此试管中吸取1mL注入另一盛有9mL无菌水的试管中，以此类推，制成10−3、10−4、10−5各种稀释度的酸奶稀释液。4.涂布将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10−3、10−4、10−5三种稀释度，然后用三支1mL无菌吸管分别由10−3、10−4、10−5三管酸奶稀释液中吸取0.2mL对号放入写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂布棒轻轻地涂布均匀。5.培养将接种后的平板后倒置于37℃培养3～5d。6.纯化待菌落长出后，选中目标菌落。用接种钩或无菌牙签挑取菌落边缘，并移植于新的乳酸菌培养基。注意每一个平皿只能用于纯化1个菌。将重新接种后的平皿置于37℃环境下培养3～5d。然后，用显微镜检查菌落是否单纯，若有其他菌混杂，就要再进行一次分离、纯化，直到获得纯培养。7.保藏将分离到的目标菌接种于乳酸菌培养基斜面上，37℃培养至斜面长满。然后保存至4℃冰箱备用。