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内容第五节基因的表达第六节基因工程菌的稳定性第七节基因工程菌的发酵(自学)第八节基因工程药物的分离纯化(自学)第九节基因工程药物的质量控制第十节基因工程药物制造实例第五节基因表达1、概述2、基因工程对宿主细胞的要求3、宿主细胞的种类概述1、基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。2、基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物。3、克隆蛋白质药物基因的一个主要目的使为了高效的表达该基因，从而大量地市场原本难以获得的药物。4、进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关键。最佳的基因表达体系：目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高和表达产物容易分离纯化。基因工程对宿主细胞的要求宿主细胞是基因克隆中重组DNA分子的繁殖场所，适当的宿主细胞，必须符以下条件：①容易获得较高浓度的细胞；②能利用易得廉价原料；③不致病、不产生内毒素；④发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；⑤容易进行代谢调控；⑥容易进行DNA技术操作；⑦产物的产量、产率高，且易提取纯化。大肠杆菌枯草芽胞杆菌链霉菌常用有酵母丝状真菌哺乳动物细胞原核细胞真核细胞宿主细胞的种类主要基因工程表达体系比较大肠杆菌特点：1、分子遗传学研究深入，生长迅速,是基因工程研究中采用最多的原核表达体系;2、大肠杆菌中的表达不存在信号肽，故产品多为胞内产物，因而造成提取困难;3、真核蛋白质常形成不溶性的包涵体;4、大肠杆菌的表达不存在翻译后修饰作用，故对蛋白质产物不能糖基化，因此，在应用上受到一定的限制。5、目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应。6、大肠杆菌会产生很难除去的内毒素，还会产生蛋白酶而破坏目的蛋白质。真核基因在大肠杆菌中的表达形式1、以融合蛋白的形式表达药物基因2、以非融合蛋白的形式表达药物基因3、分泌型表达药物基因以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白。优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达；缺点：只能作抗原用。非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。优点：保持原有蛋白活性；缺点：易被蛋白酶破坏。优点：在周质中稳定，有活性，不含蛋氨酸残基；缺点：产量不高，信号肽不被切割1、分泌能力强，可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体。2、产物蛋白质不能糖基化。3、有很强的胞外蛋白酶对产物降解。因此，它的应用也受到限制。枯草芽胞杆菌链霉菌1、不致病、使用安全；2、分泌能力强、可将表达产物直接分泌到培养液中；3、表达产物可糖基化；4、作为外源性基因表达受到重视。1、基因组小，世代时间短，无毒性；2、繁殖迅速，可廉价的大规模培养；3、能外分泌，简化了分离纯化工艺；4、产物可糖基化；5、已有不少真核基因成功表达。（干扰素、乙肝抗原）酵母1、分泌能力强；2、能正确进行翻译后加工（肽剪切和糖基化），而且糖基化方式与高等真核生物相似；3、有成熟的发酵和后处理工艺；4、丝状真菌（如曲霉）被确认是安全菌珠。丝状真菌1、使产物纯化变得容易。2、产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。3、动物细胞生产慢，生产率低，而且培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。4、表达的外源细胞均为传代细胞，表达产物是否致癌尚有疑问。哺乳动物细胞主要基因工程表达体系比较表达体系产物产生部位培养方式提纯产物活性潜在危性大肠杆菌多肽蛋白质菌体内容易一般对原核好不大融合蛋白质部分高产对真核差酵母多肽蛋白质菌体内容易菌体内真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高产稍复杂天然产物哺乳动物完整外分泌较难成本高简单可达天然需注意糖基化蛋白可高产产物致癌什么是包涵体？第六节基因工程菌的稳定性一、质粒不稳定产生的原因分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。(常见)结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。二、工程菌的质粒不稳定因素：1、含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；2、这两种菌的生长速率差异的大小。质粒稳定性的分析方法样品不含抗性标记抗生素平板培养基10-12h100个菌落含抗性标记抗生素平板培养基10-12h统计生长菌落数重复三次,计算比值(稳定性)工程菌的培养过程：①通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；②通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案和顺序。第七节基因工程菌的发酵（自学）菌种一级种子摇瓶二级种子罐培养扩大培养原料发酵培养灭菌发酵生产代谢产物分离基配制微生物工业发酵过程简图一、基因工程菌的培养方法1.补料分批培养：将种子介入反应器中进行培养，经过一端时间后，间歇或连续加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。通常把溶氧控制与加补料结合起来进行。2.连续培养：将种子借入发酵反应器中，搅拌培养基至一定菌体浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释进行不间断的培养。3.透析培养：利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养基中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。4.固定化培养：将固定化技术用于工程菌的培养，质粒稳定性大大提高，特别是对分泌型菌种。二、基因工程菌的发酵工艺基因工程菌的发酵工艺传统微生物发酵工艺材料带外源基因重组载体的微生物不含外源基因的微生物目的使外源基因高效表达自身基因表达所产生的宿主本身蛋白、初级或次极代谢产物1、培养基的影响碳源对菌体的生长和外源基因的表达有较大的影响。如以甘油为碳源，菌体得率较大，而以葡萄糖为碳源菌体产生的副产物较多。葡萄糖对lac启动子有阻遏作用,采用流加措施,控制培养液中葡萄糖的较低浓度,可减弱或消除葡萄糖的阻遏作用。碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。其他：无机盐、微量元素维生素、生物素等。2、接种量的影响接种量：指移入的种子液体积和培养液体积的比例。比例大小响发酵的产量和发酵周期。接种量：量过小，延长菌体延迟期，不利于外源基因的表达，采用大接种量，由于种子液中含有大量水解酶，有利于对基质的利用；量过大，使菌体生长过快，代谢产物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。3、温度的影响温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子的合成水平上。4、溶解氧的影响溶解氧是发酵培养中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。维持较高水平的DO2值（40%）有利于重组质粒细胞的生长及外源蛋白产物的形成。5、诱导时机的影响一般在对数生长期或对数生长后期进行升温诱导表达。6、pH的影响如采用两段培养工艺，培养前期着重于优化工程菌的最佳生长条件，培养后期着重于优化外源蛋白的表达条件。细胞生长期的最佳pH范围在6.8-7.4，外源蛋白表达的最佳pH为6.0-6.5。三、基因工程菌的培养设备发酵罐组成：发酵罐体、搅拌器、温度控制系统、灭菌系统、空气过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统、培养液配制及连续操作装置。第八节基因工程药物的分离纯化一、概述二、基因工程药物的特点三、分离纯化工艺的根据（自学）四、分离纯化的技术概述由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个步骤包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。(1)目的产物在初始原料中的含量较低;(2)含目的产物的初始物料组成复杂；除了目的产物外,还有大量的细胞、代谢、残留培养基、无机盐等，特别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大；基因工程药物（生物技术）的特点(3)目的产物的稳定性差；具有生物活性的物质对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，容易是其失活、变性(4)产物种类繁多；包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各异的生物活性物质。(5)应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热源。分离纯化工艺的根据1、含目的产物的起始物料的特点：利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程中的各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。（1）菌种类型及其代谢特性：包括菌种的生物学性质，产物和副产物种类、产物在细胞内所处的位置，表达方式（胞内、胞外、包含体），代谢物种类、产物类似物、毒素和能降解产物的酶类等；（2）原材料和培养基的来源及其质量；（3）生产工艺和条件：包括灭菌方式和条件，生产方式（连续、批式、半连续），生产周期，生产能力，工艺控制条件因素几方式等；（4）初始物料的物理、化学和生物学特性：包括产物浓度、主要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、pH、黏度、流体力学性质和热力学性质。2、物料中杂质的种类和性质物料中杂质的含量、性质、结构、相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥发性、吸附性能等。3、目的产物特性产物的化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物学活性、亲和性、配基种类、表面活性等。4、产品质量的要求产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的要求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种类和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性等。分离纯化的技术一、分离纯化技术要求二、分离纯化的技术1、细胞破碎与固液分离2、目的产物的分离纯化3、非蛋白质杂质的去除三、常用分离方法的比较分离纯化技术要求（1）技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；（2）选择性要好，能从复杂的混合物中有效的地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数；（3）收率要高；（4）两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整，这样可减少工艺步骤；（5）整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。（1）细胞收集：离心和膜过滤（2）细胞破碎：机械法---高压匀浆、超声波、高速珠磨、高压挤压等。非机械法----酶溶、化学渗透、热处理、渗透压冲击法。（3）固液分离：分离细胞碎片是比较困难。一般用离心和膜过滤。1、细胞破碎与固液分离分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术（离子交换层析、反相色谱、亲和层析、凝胶过滤等）。2、目的产物的分离纯化⑴离子交换层析（ionexchangechromatographyIEC）离子交换层析的基本原理:通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。它具有分辨率高容量大操作容易，该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。⑵反相色谱（reversedphasechromatography，RPC）和疏水色谱（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。反相色谱是利用溶质分子中非极性基团与非极性固定相之间相互作用力的大小以及溶质分子中极性基团与流动相中极性分子之间在相反方向作用力的大小差异进行分离的。常用固定相为硅胶烷基键合相。流动相为低离子强度的酸性水溶液，加入能与水互溶的乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂。由于固定相骨架疏水性强，吸附的蛋白质需用有机溶剂才能洗脱下来。疏水色谱的原理与反相色谱的原理相似，主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互作用力增强。固定相介质表面的疏水性比反相色谱介质表面的疏水性弱。为有机聚合物键合相或大孔硅胶键合相。流动相为pH6～8盐水溶液。在高盐浓度时，蛋白质分子中疏水性部分与介子的疏水基团产生疏水性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白质疏水性作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，