第二章基因工程制药(一)

第二章基因工程制药(一）第二章基因工程制药2一、概述生物技术的核心就是基因工程，基因工程技术最成功的应用就是用于生物治疗的新型生物药物的研制。传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因素的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等问题，促使人们寻求安全、实用、疗效可靠的新方法来制备生物药物。第二章基因工程制药3应用基因工程技术可十分方便且有效地解决上述提到的问题，从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质。癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等方面的预防、治疗和诊断已可通过基因工程技术获得。第二章基因工程制药4利用基因工程技术生产的药物包括医用活性蛋白和多肽：免疫性蛋白，各种抗原和单克隆抗体；细胞因子，干扰素、白介素、生长因子；激素:胰岛素、生长激素；酶类:尿激酶、链激酶、蚓激酶、超氧化物歧化酶。第二章基因工程制药5利用基因工程技术生产药物的优点可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障；可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；第二章基因工程制药6利用基因工程技术生产药物的优点内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；如白细胞介素-2的第125位半胱氨酸是游离的，有可能引起-S-S-键的错配而导致活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素-2的活性以及热稳定性均有提高；可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。第二章基因工程制药7二、基因工程药物生产的基本过程基因工程技术就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。第二章基因工程制药8基因工程药物制造的主要程序获得目的基因组建重组质粒构建基因工程菌或细胞培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检验成品检验原料包装第二章基因工程制药9第二章基因工程制药10基因工程药物生产的上游和下游技术上游技术：主要指的是目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成；下游技术：主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。第二章基因工程制药11三、目的基因的获得对于原核生物，其基因总量不大，可以选用合适的限制性核酸内切酶切下目的基因。对于真核生物不能进行直接分离。真核细胞中基因总量较大，从染色体中直接分离纯化目的基因极为困难。另外，真核基因一般都有内含子，如果以原核细胞作为表达系统，即使分离出真核基因，由于原核细胞缺乏mRNA转录后的加工系统，真核基因转录的mRNA也不能被加工、拼接成为成熟的mRNA，因此不能直接克隆真核基因。第二章基因工程制药12克隆真核基因的方法逆转录法化学合成法第二章基因工程制药13什么是逆转录法先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成互补cDNA，然后进行互补cDNA的克隆表达。从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA(complementaryDNA)，再以互补DNA为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶作用下，最终合成编码该蛋白质的双链DNA序列。该序列不含内含子。第二章基因工程制药14逆转录法的步骤mRNA的纯化cDNA第一链的合成cDNA第二链的合成cDNA克隆将重组体导入宿主细胞cDNA文库的鉴定目的cDNA克隆的分离和鉴定第二章基因工程制药15mRNA的纯化细胞内含有三种RNA，mRNA占RNA总量的2%-5%，相对分子量大小不一致，分离也有很大的困难。但是mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸（polyA）组成的末端，长达20-250个腺苷酸，足以吸附于寡聚胸苷酸（OligodT）-纤维素上，从而可以用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA上分离出来，可得到纯度较高的mRNA。mRNA(messengerRNA)，信使RNArRNA(（ribosomalRNA），核糖体RNA，tRNA(（tranferRNA），转移tRNA）、第二章基因工程制药16mRNA的纯化用高浓度盐溶液使mRNA特异结合于寡聚dT。再以低盐溶液和蒸馏水将其洗脱，经过两次寡聚dT，可得到较纯的mRNA。第二章基因工程制药17cDNA第一链的合成一般mRNA都带有3‘-polyA，所以可用寡聚dT作为引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。在合成反应体系中加入一种放射性标记的dNTP，在反应中以及反应后可通过测定放射性标记的dNTP掺入量，计算出cDNA的合成效率。第二章基因工程制药18cDNA第一链的合成在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的分子大小，探索最佳反应条件。一次好的逆转录反应可使寡聚dT选出的mRNA有5%~30%被拷贝。第二章基因工程制药19cDNA第二链的合成先用碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以cDNA第一链为模板合成第二链。由于第一链cDNA链3‘末端往往形成一个发夹形结构，所以，可以从这一点开始合成cDNA第二链。核糖核酸酶H(RNaseH)是一种核糖核酸内切酶，它能够特异性地水解杂交DNA链上的RNA磷酸二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链。该酶不能消化单链或双链DNA。第二章基因工程制药20cDNA第二链的合成此反应是在DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1专一性切除单链DNA，因此用它可以切除发夹结构。发夹结构结构切除后，双链cDNA分子的大小常用变性琼脂糖凝胶电泳进行测定。第二章基因工程制药21cDNA克隆用于cDNA克隆的载体有两类：质粒DNA（如pUC、pBR322等）和噬菌体DNA（如gt10、gt11等）。根据重组后插入的cDNA是否能够表达、能否经转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为表达型和非表达型载体。pUC及gt11为表达型载体，在cDNA插入位置的上游具有启动基因顺序；而pBR322及gt10为非表达型载体。第二章基因工程制药22cDNA克隆在cDNA克隆操作中应该根据不同的需要选择适当的载体。cDNA插入片段小于10kb，可选质粒载体，如大于10kb则应选用噬菌体DNA为载体。选用表达型载体可以增加目的基因的筛选方法，有利于目的基因的筛选。第二章基因工程制药23将重组体导入宿主细胞体外包装的噬菌体，感染感受态大肠杆菌形成噬菌斑。或转化感受态大肠杆菌使质粒进入细胞内。第二章基因工程制药24cDNA文库的鉴定根据重组体的表型进行筛选，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑颜色改变法。然后采用凝胶电泳、分子杂交、DNA序列分析测定等方法进行进一步筛选和鉴定。第二章基因工程制药25目的cDNA克隆的分离和鉴定从cDNA文库中分离特异的cDNA克隆主要采用：核酸探针杂交法：用层析和高分辨电泳等技术纯化微克量的目的蛋白质。根据目的蛋白质纯品的氨基酸序列分析结果，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。第二章基因工程制药26目的cDNA克隆的分离和鉴定免疫反应鉴定法：在既无可供选择的基因表型特征，又无合适探针的情况下，本法是重要途径。用表达型载体构建的cDNA文库，可用免疫学方法分组逐一鉴定各cDNA的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻找相应的特异cDNA克隆。第二章基因工程制药27目的cDNA克隆的分离和鉴定分离得到含有目的基因的阳性克隆后，必须对其作进一步的验证和鉴定，主要是进行限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序以及确定基因的转录方向、转录起始点等。1985，PCR发明以后，RT-PCR得到了广泛的应用。第二章基因工程制药28化学合成法较小的蛋白质或多肽的编码基因可以采用人工化学合成法合成。其先决条件是已知目的基因的核苷酸序列，或已知蛋白质的氨基酸序列，按相应的密码子推导出DNA的碱基序列。用化学方法合成目的基因不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。第二章基因工程制药29人工化学合成的限制不能合成太长的基因，50~60bp。人工合成时，遗传密码的简并性可导致中性突变，为选择密码子带来很大的困难。费用较高。同一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象称为密码子的简并性第二章基因工程制药30四、基因表达基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因工程中基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。第二章基因工程制药31什么是最佳的基因表达体系目的基因的表达产量高表达产物稳定生物活性高表达产物容易分离纯化第二章基因工程制药32宿主细胞的选择适合目的基因表达的宿主细胞应满足以下要求:容易获得较高浓度的细胞能利用廉价易得的原料不致病、不产生内毒素第二章基因工程制药33宿主细胞的选择发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态容易进行代谢调控容易进行DNA重组技术操作产物的产量、产率高，产物容易提取第二章基因工程制药34基因表达的微生物宿主细胞原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌；真核细胞：酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞。第二章基因工程制药35原核细胞－大肠杆菌因为大肠杆菌的分子遗传学研究深入，生长迅速，所以目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。特点：表达基因工程产物的形式多种多样，有细胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达等，极少数还可以分泌到细胞外表达。第二章基因工程制药36大肠杆菌限制：没有信号肽，所以产品多为细胞内产物，提取时需破碎细胞，这样细胞质内其他蛋白质也释放出来，造成提取困难。因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。其内毒素很难除去。第二章基因工程制药37枯草芽胞杆菌分泌能力强，蛋白质不形成包含体产物蛋白质不能糖基化有很强的胞外蛋白酶对产物降解第二章基因工程制药38链霉菌作为外源性基因表达受到重视不致病、使用安全分泌能力强表达产物可糖基化第二章基因工程制药39真核细胞－酵母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。第二章基因工程制药40丝状真菌有很强的蛋白质分泌能力。能正确进行翻译后加工。糖基化方式与高等真核生物相似。第二章基因工程制药41哺乳动物细胞优点：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养液中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然物。缺点：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度稀。第二章基因工程制药42目前的状况目前使用最广泛的宿主仍然是大肠杆菌和酿酒酵母。因为对它们的遗传背景研究得比较清楚，建立了许多适合于它们的克隆载体和DNA导入方式。并且许多外源在这两种宿主菌中得到表达成功。第二章基因工程制药43大肠杆菌中的基因表达基因工程的目的和基本手段，是选用合适的载体（vector)把供体DNA（外源基因）运载到受体细胞内，从而复制扩增大量的目的DNA分子或转录表达为相应的产物。第二章基因工程制药44理想载体的条件根据真核基因在原核细胞中表达的特点，表达载体应具备下列条件：载体能够独立复制，有复制起点，有严紧型和松弛型，严紧型伴随宿主染色体的复制而复制，在宿主细胞中拷贝少（1-3）；松弛型的复制可不依赖与宿主细胞，在宿主细胞中拷贝多达3000个。第二章基因工程制药45应有灵活的克隆位