第二章基因工程制药(二)

第二章基因工程制药(二）第二章基因工程制药2影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素外源基因在宿主中的表达受许多因素影响的，所以在建立表达体系时要综合考虑各种因素的作用，建立一个合适的表达体系，从而使外源基因得到最大的表达量，获得最多的表达产物。第二章基因工程制药3外源基因的拷贝数外源基因是克隆到载体上的，所以载体在宿主中的拷贝数就直接与外源基因的表达相关，应将外源基因克隆到高拷贝的质粒载体上，这对于提高外源基因的总体表达水平非常有利。第二章基因工程制药4外源基因的表达效率启动子的强弱核糖体接合位点的有效性SD序列和起始密码ATG的间距密码子组成第二章基因工程制药5表达产物的稳定性利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中自身的信号肽，把真核基因产物运输到胞浆周质的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解；组建融合基因，产生融合蛋白；采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性；选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞。第二章基因工程制药6细胞的代谢负荷外源基因的表达产物属于异己物质，并可能对宿主细胞有毒性。调节表达物质的积累与细胞的生长和代谢之间的平衡有利于外源基因的高效表达。另外通过将细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段，或将宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开两种手段也可以减轻细胞代谢的负荷。形成不溶性的包含体可以降低表达产物对宿主细胞的毒害作用。第二章基因工程制药7工程菌的培养条件除宿主、载体和克隆基因三者之间的关系影响外源基因的高水平表达外，培养条件亦是非常值得研究的因素。优化培养条件使外源基因大量表达。第二章基因工程制药8真核基因在大肠杆菌中的表达形式三种表达形式：融合蛋白非融合蛋白分泌型。第二章基因工程制药9融合蛋白形式表达药物基因融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，这样的蛋白质是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的。优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达。缺点：只能作抗原用。原核多肽序列可能会影响真核蛋白的免疫原性。可再切割成两个多肽链。第二章基因工程制药10非融合蛋白形式表达药物基因非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。优点：保持原有蛋白活性。缺点：易被蛋白酶破坏。第二章基因工程制药11分泌型表达药物基因将外源基因接到信号肽之后，使之在胞质内有效地转录和翻译，当表达的蛋白质进入细胞外膜和细胞内膜之间的周质后时，被信号肽酶识别切割，从而释放出有生物活性的外源基因表达产物。优点：在周质中稳定，有活性，不含蛋氨酸残基。缺点：产量不高，信号肽不被切割。第二章基因工程制药12酵母中的基因表达载体：酵母载体是可以携带外源基因在在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的DNA或RNA单位。从大肠杆菌中制备质粒要比从酵母中容易得多，因此酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的，只有在最后阶段在转入酵母中。第二章基因工程制药13载体的复制系列分四类：Yep类（yeastepisomalplasmid，酵母附加体质粒）YRp类（yeastreplicationplasmid，酵母复制型质粒）YCp类（yeastcentromericplasmid，酵母着丝粒质粒）YIp类（yeastintegrativeplasmid，酵母整合型质粒）第二章基因工程制药14表达载体普通表达载体：只能方便地引入外源基因并进行表达，对表达产物的组成，特别是对其氮末端氨基酸是否有增减并无严格要求。精确表达载体：要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有内切酶位点，以利于接入外源基因，并使它在表达和加工后氮末端氨基酸序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸。第二章基因工程制药15影响目的基因在酵母菌中表达的因素外源基因的拷贝数外源基因的表达效率外源蛋白的糖基化宿主菌株的影响第二章基因工程制药16外源基因的拷贝数拷贝数要适当，高拷贝数的质粒载体可使外源基因高效表达，但会引起细胞生长量的降低，单拷贝的质粒载体对细胞的最大生长没有影响，能达到较高效的表达。第二章基因工程制药17外源基因的表达效率要使外源基因在酵母中表达必须将外源基因克隆到酵母军表达载体的启动子和终止子之间，构成表达框架。分泌信号包括信号肽部分以及前导肽部分的编码序列，它帮助后面的表达产物分泌出酵母细胞，并在适当的部位由胞内蛋白酶加工切断表达产物与前导肽之间的肽键，产生正确的表达产物。终止序列保证了转录产物在适当的部位终止和加上多聚腺苷酸尾巴，这样形成的mRNA可能比较稳定并被有效地翻译。第二章基因工程制药18外源蛋白的糖基化外源蛋白在酵母细胞中可发生N-糖苷键和O-糖苷键连接的两种不同的糖基化。外源蛋白经糖基化后可以以有效的活性型分泌到培养基中。某些蛋白质糖基化后更加稳定，便于分离精制。第二章基因工程制药19宿主菌株的影响菌体生长力强菌体内源蛋白酶要较弱菌体性能稳定分泌能力强第二章基因工程制药20动物细胞中的基因表达优点：哺乳动物细胞外源基因表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，使产物易纯化。基因产物糖基化接近天然产物。第二章基因工程制药21动物细胞中的基因表达缺点：细胞生长慢，生产率低条件刻苛，费用高培养液浓度较小表达的外源细胞均为传代细胞表达产物是否致癌尚有疑问第二章基因工程制药22主要基因工程表达体系比较表达体系产物产生部位培养方式提纯产物活性潜在危险性大肠杆菌多肽蛋白质菌体内容易一般对原核好不大融合蛋白质部分高产对真核差酵母多肽蛋白质菌体内容易菌体内真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高产稍复杂天然产物哺乳动物完整外分泌较难成本高简单可达天然需注意糖基化蛋白可高产产物致癌第二章基因工程制药23五、基因工程菌的稳定性基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。分裂不稳定：是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象；结构不稳定：是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。第二章基因工程制药24质粒不稳定产生的原因常见的是分裂不稳定，与两个因素有关：含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；这两种菌的比生长速率差异的大小。第二章基因工程制药25质粒不稳定产生的原因对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数：低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性；高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利。第二章基因工程制药26质粒稳定性的分析方法样品不含抗性标记抗生素平板培养基稀释培养10～12h随机挑选100个菌落含抗性标记抗生素平板培养基接种统计长出的菌落数培养10～12h计算比值重复三次第二章基因工程制药27提高质粒稳定性的方法为了提高质粒稳定性，工程菌培养采用两阶段培养法：先使菌体生长至一定密度再诱导外源基因的表达第二章基因工程制药28提高质粒稳定性的方法由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度。第二章基因工程制药29提高质粒稳定性的方法有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。第二章基因工程制药30六、基因工程菌生长代谢的特点菌体的生长通常用比生长速率来表示。工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。第二章基因工程制药31基因工程菌生长代谢的特点大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。培养条件的改变，都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应，影响生物大分子的和成和菌体的生长。第二章基因工程制药32菌体的生长与能量的关系碳源物质是组成培养基的主要成分。碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降，从而影响菌体的生长。适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用。第二章基因工程制药33菌体的生长与能量的关系分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。第二章基因工程制药34菌体的生长与能量的关系大肠杆菌中克隆携带氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌体生长速率。采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞，阻止乙酸产生，可提高产量。第二章基因工程制药35菌体生长与前体供应的关系在基础培养基中加入氨基酸能使菌体比生长速率提高，使蛋白质合成增加。由于菌体中小分子前体量和催化结构是有限的，因而生物大分子的合成处于亚饱和状态，基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，限制了菌体的比生长速率第二章基因工程制药36质粒存在对菌体代谢的影响同样培养基当中，工程菌的比生长速率低于其宿主细胞。中等拷贝质粒（56拷贝）的工程菌中与前体合成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。高拷贝质粒的工程菌（240拷贝）中，生长速率和菌体总蛋白合成均减少。第二章基因工程制药37七、基因工程菌发酵基因工程菌的培养过程包括:通过摇瓶操作基因工程菌生长的基础条件,如温度、pH、培养基各种组分、碳氧比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响;通过培养罐操作确定培养参数和控制方案以及顺序。第二章基因工程制药38微生物工业发酵过程图解菌种原种一级种子摇瓶扩大培养发酵培养基配制二级种子罐培养灭菌发酵生产代谢产物分离第二章基因工程制药39基因工程菌的培养方式补料分批培养连续培养透析培养固定化培养第二章基因工程制药40补料分批培养将种子接入反应器中后，培养一段时间，然后间歇或连续补加新鲜培养基，使菌体进一步生长。为保持基因工程菌生长所需的良好环境，延长对数生长期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和补料措施结合起来，根据生长规律来调节补料速率。第二章基因工程制药41连续培养将种子接入反应器后，培养一段时间，到一定菌浓，开动蠕动泵，同时进料和出料，控制一定稀释速率。由于基因工程菌不稳定，可将生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。关键的控制参数是诱导水平、稀释率、细胞比生长速率。第二章基因工程制药42透析培养利用膜的半透性使代谢产物和培养基分离。通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响第二章基因工程制药43固定化培养基因工程菌固定化后，质粒的稳定性大大提高。便于进行连续培养，特别是对于分泌型菌更为有利。第二章基因工程制药44基因工程菌的发酵工艺基因工程菌的发酵与传统的微生物发酵不同,基因工程菌带外源基因,发酵的目的是使外源基因高效表达。它不仅涉及宿主载体和克隆基因之间的相互关系还和环境有关。工艺要求：外源基因既高效表达，又有利于产品分离纯化第二章基因工程制药45对发酵影响较大的几个因素培养基接种量温度溶解氧诱导时机pH第二章基因工程制药46培养基的影响培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又要保持工程菌的稳定性，使外源基因高效表达。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。还有无机盐、维生素等。第二章基因工程制药47培养基的影响不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达有较大的影响。使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不大。但使用甘油菌体得率较大，而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多。葡萄糖对lac启动子有阻遏作用。乳糖对lac启动子有利。第二章基因工程制药48培养基的影响在氮源中，酪蛋白水解物有利于产物的合成与