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第三节基因工程制药生产的基本过程一、工具酶的分离纯化二、载体的分离纯化三、外源DNA和目的基因的分离和获得四、外源DNA与载体DNA的切割与连接五、宿主细胞的选择和基因导入操作六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点七、基因工程菌中试八、基因工程菌的扩增和发酵生产九、基因工程药物的分离和纯化技术十、变性蛋白的复性十一、基因工程药物的质量控制十二、基因工程药物的制造实例血红蛋白基因血红蛋白基因排列顺序血红蛋白的结构血红蛋白的运送氧气功能血红蛋白的基因工程流程一、工具酶的分离纯化（一）基因工程制药所用到的工具酶（二）关于限制酶（三）关于连接酶（一）基因工程制药所用到的工具酶限制性内切酶甲基化酶Klenow聚合酶T4-DNA聚合酶T4-多核苷酸激酶碱性磷酸酶核酸酶-S1核酸酶-Bal31绿豆核酸酶核糖核酸酶人外切核酸酶DNA酶-1外切RNA酶-III外切RNA酶-VIDNA聚合酶1T4-DNA连接酶末端脱氧核苷酸转移酶T4-RNA连接酶逆转录酶大肠杆菌-DNA连接酶（二）关于限制酶1、宿主限制现象2、限制酶的定义3、限制酶的特征4、限制酶的作用5、基因工程所用到的限制酶6、影响限制酶作用的因素1、宿主限制现象病毒或噬菌体在宿主A细胞中生长良好,但在宿主B细胞中生长很差,原因是它的DNA受到宿主B的限制,这种现象是宿主控制性限制（restriction）与修饰(modification),简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。R/M体系：是由两种酶活性配合完成的：一种是修饰的甲基转移酶另一种是核酸内切限制酶E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶※当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。※EcoB(大肠杆菌B株)的核酸酶不能识别已甲基化的序列。R/M体系的作用：保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解TGAN8TGCTACTN8ACGATGAN8TGCTACTN8ACGAECOB核酸酶甲基化酶CH3CH3CH3CH3噬菌体来源序列宿主来源序列※限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。※由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。2、限制酶的定义凡是能够识别和切割DNA分子内特定核苷酸顺序的酶称为限制酶。限制酶分为三个类型：（1）Ⅰ型限制酶-----由于其切点不固定，很难形成特异性的切割末端。（2）Ⅱ型限制酶-----是位点特异性酶，是基因工程理想的工具酶。（3）Ⅲ型限制酶-----对DNA的识别与切割点不同，不产生特异性DNA片段。3、限制酶的特征具有专一性的识别位点。能够形成固定的核苷酸单链末端。比较适合于进行DNA结构的分析和进行基因重组。4、限制酶的作用（1）进行DNA重组。（2）构建新载体。（3）构建基因文库。（4）进行DNA序列分析。（5）制备DNA放射性探针。5、基因工程所用到的限制酶通常是Ⅱ型限制酶，具体有以下几种。EcoR-IHind-IIIBamH-IPst-ISst-ISal-IAva-IBcl-IHind-IIHpa-IBgl-IICla-IHae-IIIHha-IHinf-IHpa-IIMbo-ISma-IXba-IXho-I6、影响限制酶作用的因素（1）DNA的纯度（2）DNA的甲基化程度（3）DNA的结构（4）反应的温度----最适温度为37度（5）反应的缓冲体系----反应体系中通常含有MgCl2、NaCl、KCl、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、牛血清白蛋白。它们具有激活酶、稳定酶的作用。（三）关于连接酶1、定义----凡是能够催化DNA片段5’-末端的磷酰基与3’-末端的羟基结合成磷酸二酯键的酶，称为连接酶。2、作用----主要用于（1）正常DNA的合成。（2）损伤DNA的修复。3、种类（1）DNA-连接酶----广泛存在于生物细胞之中，主要取自于大肠杆菌E.coli。（2）T4-DNA连接酶----来自于经过T4-噬菌体感染的大肠杆菌E.coli。（3T4-RNA连接酶----催化单链DNA或RNA的5‘磷酸与另一单链DNA或RNA的3’羟基之间形成共价连接。二、基因工程载体的分离纯化（一）定义（二）基因工程载体的必备条件（三）基因工程载体的种类（一）定义能够将目的基因携带进宿主细胞、并可使得目的基因能够在宿主体内进行自主性复制的遗传因子，称为基因工程载体。（二）基因工程载体的必备条件（1）具有有效运载能力。（2）载体自身能够独立复制，并且在宿主体内进行自主性复制。（3）载体在携带目的基因之后，还能够在宿主体内进行自主性复制。（4）在宿主体内，能够控制外源基因的表达活动。（5）能够携带大小不同的外源性目的基因。（6）鉴定方便、装卸技术简单。（7）容易控制、安全可靠。（8）应具有灵活的克隆位点、并且有方便的筛选标记。（9）应具有很强的启动子。（10）应具有阻遏子，使启动子受到控制，因为外源基因的高效表达会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏子可使宿主细胞免受这种影响。（11）应具有很强的终止子，以便重点克隆外源基因区段，而不转录其它无关基因。（12）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即含有起始密码AUG和SD序列，以便转录之后能够顺利于进行翻译。（三）基因工程载体的种类1、细菌质粒2、真核基因病毒DNA3、λ噬菌体DNA4、单链DNA噬菌体M13载体5、人工质粒载体----科斯质粒6、酵母人工染色体7、其他载体1、细菌质粒（1）质粒的定义（2）质粒的特性（3）质粒的分类（4）质粒载体的具备条件（5）常用的细菌质粒（1）质粒的定义存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，常带有细菌的抗药基因。也存在于某些真核细胞（酵母的2μ环状质粒）质粒载体(plasmid)（2）质粒的特性独立于细菌染色体之外的环状DNA或RNA。其遗传特性属于非染色体控制。能够进行自我复制。容易在宿主体内进行转移和迁移。可编码宿主染色体所不具有的基因。能够赋予宿主额外的遗传特性：A、编码产生抗生素酶的抗性基因，B、编码产生糖酵解酶系的基因，C、编码产生抗重金属酶的抗性基因。质粒的复制类型◆严谨型（strigentplasmid)：复制与宿主染色体同步受宿主染色体复制的限制，在宿主细胞中拷贝数低约１～３份拷贝。◆松弛型（relaxedplasmid):复制不受宿主染色体复制的限制可独立复制，在宿主细胞中拷贝数高，宿主细胞中质粒有10-200拷贝。基因工程常用载体。质粒DNA的构型三种不同的构型：当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称为共价闭合环形DNA(cccDNA)，这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型；如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA(ocDNA)；若质粒DNA的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称为L构型。单链切割连接单链切割连接共价闭合环形DNA（SC型）开环DNA（oc型）线性DNA（L型）环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型（3）质粒的分类F质粒----可使宿主A的部分基因随着F质粒一起转移到不存在该质粒的另一宿主B的体内。R质粒----可编码宿主A的一种或者数种抗生素抗性基因，并能够将它们带到不存在该质粒的另一宿主B的体内，使得宿主B也获得同样的抗性。Col质粒----能编码大肠杆菌毒素基因，通过表达之后产生的大肠杆菌毒素可以使得不带Col质粒的其它菌株死亡。（4）质粒载体具备条件质粒载体，也称质粒克隆载体，是指用于实现基因工程操作的质粒。必须具备以下条件：（1）其分子结构中必须具有多个单一限制酶的切割位点。（2）构建重组质粒之后必须具有转化功能。（3）分子量较小，易于操作。（4）宿主范围较为单一、无感染性。（5）常用的细菌质粒pBR322pBH10pBH20pTR262pAT153pXf3Pmk16pGEM-3ZpUC19[A]、pBR322质粒[B]、pUC19质粒[C]、pGEM-3Z质粒[A]、pBR322质粒①4363bp②含一个复制点③含一个抗氨卞青霉素基因(ampR)④一个抗四环素基因(tetR)⑤ampR和tetR抗性基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入当外源基因插入抗药基因内，抗药基因失活。AmpR→Amp敏感(AmpS)、TetR→Tet敏感(TetS).pBR322:人工构建重要质粒优点：具有较小的分子量．具有两种抗生素抗性基因，作为筛选标记．具有高拷贝数．是松弛型质粒．[B]、pUC系列质粒由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体；（1）2674bp；（2）有ampR和位于lacZ+基因中靠近5’端多克隆位点(MCS)和来源于pBR322质粒的复制起始点（3）大肠杆菌β-半乳糖苷酶(lacZ)的启动子及其编码该基因氨基端α-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ+基因，便于蓝白筛选pUC质粒优点：１．具有更小的分子，更高的拷数２．适于组织化学检测重组体．[C]、pGEM-3Z质粒含一个ampR基因和一个lacZ’编码基因;有多克隆位点（MCS）;正选择颜色标记lacZ’;有两个来自噬菌体的强启动子PT7和PSP6,用于外源基因的高效表达注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3ZPSP62、真核基因病毒DNA（1）病毒载体的优点（2）已经研究的真核基因病毒DNA（1）病毒载体的优点[A]、具有很高的拷贝数量。[B]、有强大的启动子。[C]、可保证目的基因的高效表达。（2）已经研究的真核基因病毒DNA[A]、SV40病毒DNA[B]、牛乳头瘤病毒[C]、RNA病毒[D]、昆虫杆状病毒[E]、人痘病毒DNA[F]、猴空泡病毒DNA[G]、人腺病毒DNA[H]、人牛痘病毒DNA[I]、逆转录病毒载体[A]、SV40病毒DNA（A1）、SV40病毒DNA的特性（A2）、SV40病毒DNA的基因组（A3）、SV40病毒DNA载体的构建（A4）、SV40病毒DNA载体的使用方法（A1）、SV40病毒DNA的特性为环状双螺旋结构。其宿主为动物细胞。SV40病毒有二种表达方式：（1）游离表达方式，SV40DNA+外源性DNA，形成重组DNA，进入宿主体内，以重组DNA的方式表达。（2）结合表达方式，重组DNA整合到宿主染色体的DNA之中，与染色体基因一起表达。（A2）、SV40病毒DNA的基因组（A3）、SV40病毒DNA载体的构建（A4）、SV40病毒DNA载体的使用方法[G]、腺病毒（G1）、腺病毒DNA载体（G2）、腺病毒DNA载体的特点3、λ噬菌体DNA（1）λ噬菌体DNA的特性（2）λ噬菌体DNA的改造（3）λ噬菌体DNA的体外包装（4）λ噬菌体载体的构建（5）λ噬菌体载体的使用（6）λ噬菌体载体的优点（1）λ噬菌体DNA的特性λ噬菌体DNA为双链的DNA病毒，宿主是大肠杆菌。已发现λ噬菌体DNA可编码61个基因。[A]、λ噬菌体DNA在宿主体内的生活方式[B]、λ噬菌体DNA的结构[A]、λ噬菌体DNA在宿主体内的生活方式（1）溶源方式：λ噬菌体DNA整合到大肠杆菌的DNA中，伴随大肠杆菌DNA的复制而复制，这种方式是λ噬菌体DNA作为基因工程载体的理论依据。（2）溶菌方式：λ噬菌体感染大肠杆菌后，终止了大肠杆菌染色体DNA所控制的遗传信息表达，并进一步分解大肠杆菌DNA，最后导致大肠杆菌完全溶解。[B]、λ噬菌体DNA的结构λ噬菌体基因组基因组长度：约为50kb的双链DN