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第三节基因工程制药生产的基本过程一、工具酶的分离纯化二、载体的分离纯化三、外源DNA和目的基因的分离和获得四、外源DNA与载体DNA的切割与连接五、宿主细胞的选择和基因导入操作六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点七、基因工程菌中试八、基因工程菌的扩增和发酵生产九、基因工程药物的分离和纯化技术十、变性蛋白的复性十一、基因工程药物的质量控制十二、基因工程药物的制造实例十、变性蛋白的复性一、包含体及包含体形成原因二、包含体的分离和溶解三、包含体蛋白复性方法以大肠杆菌作为表达系统生产基因工程药物时,药物蛋白通常会形成无活性的蛋白聚体即包含体,它们的一级结构即氨基酸序列是正确的,但空间结构错误,没有生物学活性。需要一个复性过程才能得到生物活性蛋白。包含体是无定形的蛋白质的聚集,不被任何膜所包围。细胞破碎后,包含体呈颗粒状,致密,低速离心就可获得。欲获得天然活性态的目标产物,必需分离包含体后,溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。包含体的优势：1、富集目标蛋白：包含体具有高密度，易于分离纯化的优势；2、抗蛋白酶：重组蛋白以包含体的形式存在有效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降解；3、对宿主毒性小：生产那些处于天然构象对宿主细胞有毒害的蛋白有优势。一、包含体及包含体形成原因包含体定义:细胞内不溶性表达,即蛋白在不适宜于折叠的环境中表达后形成不溶性产物。包含体形成原因：蛋白高水平表达时新生肽链的聚集速率﹥蛋白正确折叠速率包含体形成重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺少一些折叠所需的酶和辅助因子（折叠酶和分子伴侣）。包含体的组成与特性：一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，无定形，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。二、包含体的分离和溶解包含体难溶于水中，在变性剂溶液（如盐酸胍、脲）中才能溶解，溶解的蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏。当除去变性剂时，一部分蛋白质可自动折叠成具有活性的正确构型，此折叠过程为蛋白质的复性。1、包含体的分离收集重组菌，破碎细胞；离心除上清；使用变性剂洗涤沉淀。2、包含体的溶解打断包含体蛋白分子内和分子间的各种化学键，使多肽链伸展。溶解采用强的变性剂，如脲、盐酸胍或硫氰酸盐，SDS，各种溶解方法都各有利弊。含有半胱氨酸的蛋白质，需要加入还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇等。加入金属螯合剂EDTA去除金属离子。三、包含体蛋白复性方法几个要求：活性蛋白的回收率高正确的复性的产物易于与错误的折叠蛋白质分离。折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品复性过程耗时少1稀释、透析复性法2含二硫键的蛋白复性3封闭蛋白的疏水簇促进复性4凝胶过滤层析复性5小分子添加剂促进复性6分子伴侣或折叠酶促进的复性7人工分子伴侣促进的复性8减缓蛋白合成速率1稀释、透析复性法高蛋白浓度将导致蛋白的聚集，复性时，变性蛋白经一系列的折叠中间体，最终形成蛋白天然构象。减少聚集最直接的方法就是降低蛋白浓度，当蛋白浓度在10-50µg/ml时，可获得较高复性率。复性前用稀释、透析等方法去除变性剂和还原剂，促进蛋白复性。2含二硫键的蛋白复性正确的二硫键重建方法：空气氧化法：利用空气中的氧气氧化折叠期间的巯基。加入氧化-还原转换试剂：如还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽加入氧化型谷胱甘肽：可使氧化型谷胱甘肽与还原的蛋白质半胱氨酸之间形成二硫复合物，而后在复性过程中除去谷胱甘肽和变性剂，并加入低浓度的半胱氨酸取代蛋白质-S-S-谷胱甘肽中的谷胱甘肽而使二硫键正确形成。亚硫酸钠/连四硫酸钠:使变性蛋白质磺化以保护巯基，复性时加入少量的还原试剂可移去保护基团而使二硫键正确配对加入DTT还原剂3封闭蛋白的疏水簇促进复性蛋白结构和序列分析来确定蛋白分子中能引起分子间相互作用的疏水簇，可用特异性结合疏水族的单克隆抗体来封闭疏水簇，从而减少分子间结合引起的聚集。4凝胶过滤层析复性为减少高浓度下的聚集反应，使用凝胶过滤层析介质的隔离作用，降低蛋白之间的相互作用所产生的聚集，大大提高了复性率。5小分子添加剂促进复性小分子添加剂可作为稳定蛋白的活性状态，降低非正确折叠分子的稳定性，增加折叠中间体的稳定性。添加剂并不加快折叠速率，只是抑制聚集发生。6分子伴侣或折叠酶促进的复性分子伴侣和折叠酶在体外帮助蛋白复性从而提高复性率，但复性后的分离较繁，如分子伴侣或折叠酶不能重复利用，将增加成本。7人工分子伴侣促进的复性变性蛋白被复性液中的去垢剂所捕获，形成蛋白-去垢剂复合物，该复合物可抑制蛋白的聚集，之后，加入环糊精从复合体中去除去垢剂，促使蛋白的重折叠。8减缓蛋白合成速率降低发酵温度、使用弱启动子、降低基因剂量等可避免或减少包含体形成十一、基因工程药物的质量控制（一）原材料的质量控制（二）培养过程的质量控制标准（三）纯化过程中的质量控制（四）目的产品的质量控制（五）产品的保存要求（一）原材料的质量控制1、重组DNA序列的正确性。2、进行重组的基因工程菌必须来自单一克隆株。3、所使用的载体、质粒必须纯正、而且稳定。4、应明确以下各事项：（1）目的基因的来源（2）限制性内切酶的种类（3）载体的名称和遗传特性（4）基因重组的位点图谱（5）抗生素标记物（6）宿主细胞的名称和来源、传代历史（7）重组染色体的生物特性、拷贝数、遗传性（8）基因表达所导读的核苷酸序列（9）启动克隆基因在工程细菌中的表达水平（二）培养过程的质量控制标准1、工程菌菌种纯正、稳定。2、每一批次的菌种不含致癌基因，无杂菌、病毒、真菌和支原体的污染。3、发酵生产过程中，工程菌表达稳定。4、生产过程控制微生物污染。5、生产过程保证产量恒定。保证工程菌的稳定性，确定细胞的最高传种代数。6、定期检测工程菌的载体系统、质粒拷贝数、载体在工程细胞内是否丢失。（三）纯化过程中的质量控制1、每一批次生产产物的一致性检验。2、外源蛋白质含量限度检验3、DNA限度检验4、热原限度检验：（1）血清学检验（2）鲎试剂（3）兔子热敏试验（四）目的产品的质量控制基因工程产品的质量控制包括7项指标。1、产品鉴别的定性分析2、纯度分析3、杂质检测4、生物活性测定5、稳定性考察6、产品一致性保证7、产品的安全性1、产品鉴别的定性分析重组蛋白质药物常用的鉴定方法:（1）重组蛋白浓度和相对分子量的检测（2）特异性检测（3）氨基酸组成（4）高效液相分析法（HPLC）（5）肽图分析法（6）部分氨基酸序列分析（7）蛋白质二硫键分析（8）核磁共振（NMR）（1）肽图分析通过酶解法、或化学降解法，对目的蛋白质的每一段肽链进行结构和成份分析的方法。肽图分析法是检测蛋白质一级结构中细微变化最有效的方法。可作为基因工程产品与天然产品之间进行精密比较的鉴别手段。方法可采用：（1）各种高效液相分析法（HPLC）（2）毛细管电泳（CE）（2）氨基酸成份分析对构成蛋白质的氨基酸单体进行测定的方法。缺点和局限性：（1）不超过50个氨基酸组成的蛋白质，测定精度较好。（2）当氨基酸数量超过100个时，会出现较大偏差。（3）相对分子量越大，其偏差就越严重。（3）部份氨基酸序列分析氨基酸EdmanN末端序列分析法，可作为蛋白质和肽链的重要测定指标。3.2氨基酸组成及顺序分析氨基酸组成水解蛋白质为氨基酸全自动氨基酸分析仪或高效液相色谱进行测定顺序分析质谱法推定法：从已知基因序列推断蛋白质氨基酸序列化学法（手工、自动）水解法Sanger法、Edman降解法、氨肽酶法肼解法、羧肽酶法各类氨基酸自动测序仪（4）重组蛋白质浓度、相对分子量测定重组蛋白质的浓度测定方法：（1）凯氏定氮法（蛋白质平均含氮量为16﹪，首先测定氮的含量，进而估算蛋白质的含量）（2）双缩脲法（3）Bradford法（4）福林-酚法（5）紫外分光光度法（芳香族氨基酸在280nm附近有最大光吸收，核酸在260nm附近有最大光吸收）重组蛋白质的相对分子量测定方法：（1）凝胶过滤法（2）聚丙烯酰胺聚胶电泳法电泳法测定未知蛋白的分子量（5）蛋白质二硫键分析二硫键的巯基与蛋白质的生物活性有着密切关系。基因工程产物中-S-S-键是否正确配对为一个重要的问题。测定方法：（1）对氯汞苯甲酸法（PCMB）（2）5、5-二巯基-双-2-硝基苯甲酸法（DTNB）2、纯度分析目的蛋白质含量测定----通常根据目的蛋白质的理化性质、生物学特性来进行测定。采用的方法有4项：（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAEG）（2）等电点电泳（3）各种高效液相分析法（HPLC）（4）毛细管电泳（CE）Isoelectricfocusing3、杂质检测杂质分为2种类型：蛋白质杂质、非蛋白质杂质。（1）蛋白质杂质的主要来源（2）非蛋白质杂质主要类别（3）常见的杂质和污染物、以及检测方法（1）蛋白质杂质的主要来源（A）残余的宿主细胞蛋白质，（B）目的蛋白质自身变性、由于蛋白酶引起的降解、由于冷冻脱盐导致的沉淀、由于冻干引起的聚合。（2）非蛋白质杂质主要类别（A）杂菌污染，通过微生物学方法来测定。（B）热原质和内毒素，检测可用鲎试剂。（C）宿主细胞所残余的DNA，一般认为DNA残余含量小于100pg/剂量，是安全的。（3）常见的杂质和污染物、以及检测方法杂质和污染物常用检测方法-----------------------------------------------------------------------------------------------1：内毒素鲎试剂、家兔热原法2：宿主细胞蛋白质免疫分析、SDS-PAGE、CE3：其它蛋白质杂质（如培养基）免疫分析、SDS-PAGE、HPLC、CE4：残余DNANA杂交、紫外光谱、蛋白结合5：蛋白变异肽谱、等电点聚焦（IEF）、HPLC、CE6：甲酰基甲硫氨酸肽谱、IEF、HPLC、CE7：甲硫氨酸氧化肽谱、氨基酸分析、质谱、Edman分析8：产物变性、聚合、脱氨基凝胶分子筛、SDS-PAGE、HPLC、CE9：单克隆抗体亲和配基脱落免疫分析、SDS-PAGE10：氨基酸取代肽谱、氨基酸分析、质谱、Edman分析11：微生物污染物微生物学检查12：支原体污染物微生物学检查13：病毒污染物微生物学检查4、生物活性测定（1）免疫测定法：重组蛋白质是一种抗原，均有相应的抗体、或单克隆抗体，可用放射免疫分析法、酶标免疫法测定其免疫学活性。（2）实验动物体内试验法：根据目的蛋白质的生物学、药理学特性，建立动物模型，进行各种指标的测定。（3）细胞培养体外效价评定法：（A）细胞培养计数法（B）3H-TαR掺入法（C）酶法细胞计数。5、稳定性考察这是评价药物有效性、安全性的重要手段。也是药品贮存条件、使用期限的主要依据。由于基因工程所生产出一蛋白质都是生物活性物质，它们对于温度、氧化、光照、离子浓度、机械剪切等环境因素均十分敏感。常常会在贮存过程中发生脱氨、氧化、磺酰化、聚合、降解等反应。稳定性试验必须与一致性试验、纯度测定、生物学效价试验等结合起来，进行多方面的综合评判。才能保证结果的客观性。6、产品一致性保证是用来保证每一批生产出的最终产品在安全性、有效、含量、杂质限度、稳定性等方面都是一致的。只有从原料开始、到生产、到产品形成的每一步骤进行严格的工艺要求、并结合严格的质量检测手段，才能保证产品的一致性恒定。7、产品的安全性三致试验：（1）致畸（2）致敏（3）致癌（五）：产品的保存要求1、液态保存2、固态保存1、液态保存（1）低温保存----在-10℃到-20℃以下的低温环境，可保存蛋白质制剂。（2）在稳定的pH条件下保存----蛋白质只有在很窄的pH范围内才能维持稳定，即当pH=pI（等电点）时，因此应该小心调整保存蛋白质的pH范围。（3）高浓度保存----蛋白质在高浓度溶液中比较稳定，而在低浓度溶液内，常常发生亚基解离、表面变性。（4）真空保存----蛋白质在真空状态、或者在惰性气体中密闭保存，能抵抗