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第二章微生物发酵制药工艺2.1微生物发酵与制药2.2微生物生长与生产的关系2.3制药微生物生产菌种建立2.4培养基制备2.5灭菌工艺2.6发酵培养技术2.7发酵工艺过程的控制2.8抗生素的生产工艺2.1微生物发酵与制药¾发酵¾发酵制药¾发酵制药的基本过程发酵制药发酵与制药1、发酵概念•概念：通过微生物培养而获得产物的过程•种类：用产品说明，冠以产物名而成，如青霉素发酵，维生素发酵•初级代谢产物：在初级代谢过程中形成的产物，包括各种小分子前体、单体和多糖、蛋白质、脂肪、核酸等。生长所必须的。几乎所有生物初级代谢基本相同。氨基酸，核苷酸，有机酸•次级代谢产物：比较复杂的化合物，不是细胞生长必需的，对生命活动有意义（抗逆境条件）。抗生素，毒素，色素发酵制药发酵与制药2、发酵制药•概念•利用制药微生物的生长繁殖，通过发酵，代谢合成药物，然后从中分离提取、精制纯化，获得药品的过程•WWI：对抗细菌性感染药物的需求，使发酵技术奇迹般应用成功。发酵制药发酵与制药菌种选育原料药包装成品检验提炼工段预处理分离提取浓缩纯化发酵工段种子制备孢子制备成品工段发酵控制实验室、种子库包装车间发酵车间提炼车间3发酵制药的基本过程发酵制药发酵与制药生长与生产的关系2.2微生物的生长与生产的关系微生物发酵过程特征微生物生长动力学影响动力学的因素动力学模型发酵制药1、微生物发酵基本过程特征（批式）发酵后期(fermentationanaphase)菌体自溶期(cellautolysisphase)发酵中期(fermentationmetaphase)产物合成（生产）期(productsynthesisphase)发酵前期(fermentationprophase)菌体生长期（cellgrowthphase）菌体生长与产物生成的特征，三个阶段生长与生产的关系发酵制药发酵前期特征•从接种至菌体达到一定临界浓度的时间，包括延滞期、对数生长期和减速期。•代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗，减少•生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。•溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。•pH变化：先升后降－先氨基酸作为碳源，释放出氨，而后氨被利用。先降后升－先用糖作为碳源，释放出丙酮酸等有机酸，后又被利用。生长与生产的关系发酵制药发酵中期特征•以次级代谢产物或目标产物的生物合成为主的一段时间。•菌体生长恒定就进入产物合成阶段•呼吸强度：无明显变化，不增加菌体数目•产物量：逐渐增加，生产速率加快，直至最大高峰，随后合成能力衰退。•对外界变化敏感：容易影响代谢过程，从而影响整个发酵进程。生长与生产的关系发酵制药发酵后期特征•菌体衰老，细胞开始自溶的一段时间•合成产物能力衰退，生产速率减慢。•氨基氮含有增加，pH上升•发酵必须结束，否则产物被破坏•菌体自溶给过滤和提取等带来困难。生长与生产的关系发酵制药2、微生物的生长动力学生长曲线：生物量或细胞数目随培养时间变化曲线。意义：描述微生物从生长到自溶死亡的整个过程。生长速率r：单位时间（t）内菌浓或质量（X）变化:比生长速率μ：单位菌体浓度的生长速率生长速率的标准化，菌体活力大小⎟⎠⎞⎜⎝⎛=XdtdX1μdtdXr=生长与生产的关系发酵制药延滞期指数生长期减速期静止期衰亡期dX/dt=μmaxXdX/dt=μXdX/dt=(μ-kd)X=0dX/dt=-kdX菌体生物量与时间的关系是S形曲线。分为五个阶段生长与生产的关系发酵制药3、影响生长动力学的因素（1）基质浓度对菌体生长的影响菌体生长过程，基质逐渐被吸收利用，浓度呈现降低。dtdSrS−=⎟⎠⎞⎜⎝⎛−=XdtdSqS1基质浓度的减少可用基质消耗速率和比消耗速率表示：生长与生产的关系发酵制药限制性基质浓度与比生长速率的关系μmax：各种基质对菌体的生长效率，不同基质之间比较。Ks：菌体对基质亲和力，Ks越小，亲和力越大，利用越好。S很低，浓度与比生长速率成正比。S很高，菌体以最大比生长速率进行生长。Ksμmax/2Monod方程：μ=μmaxS/(Ks+S)基质浓度比生长速率生长与生产的关系发酵制药随温度升高而速率增加，超过一定温度点后，随温度升高，速率迅速下降。温度生物量(2)温度在适宜的生长温度范围内，细胞生长速率和比生长速率与温度关系分别为：dX/dt=(μ-kd)X;μ=Aexp(-Eg/RT)生长与生产的关系发酵制药pH生物量pH值对菌体生长速率的影响与温度的影响类似，在适宜的pH值范围，生长速率最大(3)pH值生长与生产的关系发酵制药4、生长与生产关系的模型•Gaden把生长与生产分为三种：•I型：生长与生产偶联型•II型：生长与生产半偶联型•III型：生长与生产非偶联型生长与生产的关系发酵制药I型：菌体生长与生产偶联型couplingmodel时间菌体生长与产物生成直接关联，生长期与生产期是一致菌体生长、基质消耗、能源利用和产物生成动力学曲线几乎平行，变化趋势同步，最大值出现的时间接近.产物：初级代谢的直接产物，如有机酸，乳酸、醋酸等。XYdtdXYdtdPrPPpμ===/ppYqμ=Yp＝dP/dX生长与生产的关系发酵制药介于偶联和非偶联模型之间，产物生成与基质消耗、能量利用之间存在间接关系。生长期期内，无产物生成，生长中后期生成大量的产物产物：氨基酸的发酵，一部分组成型表达的蛋白质药物时间XXdtdPrpβαμ+==βαμ+=pqII型：生长与生产半偶联型semi-couplingmodel生长与生产的关系发酵制药生长期与生产期在独立的两个阶段先形成物质消耗和生长高峰后菌体静止期，产物大量生成，出现产物高峰。抗生素等次级代谢产物诱导型基因工程菌的生产时间XdtdPrpβ==β=pqIII型：生长与产物生成非偶联型,non-couplingmodel生长与生产的关系发酵制药小结微生物发酵过程特征：前、中、后期微生物生长动力学：生长速率与比生长速率影响动力学的因素：基质浓度（基质消耗、Monod方程）、温度、pH动力学模型:偶联、非偶联、半偶联，生长与生产之间的关联发酵制药思考题（1）微生物发酵过程可分为几个时期，各有何特征？（2）描述微生物生长动力学过程，分析其影响因素。（3）分析微生物生长与生产之间的关联模型。发酵制药第二章微生物发酵制药工艺2.1微生物发酵与制药2.2微生物生长与生产的关系2.3制药微生物生产菌种建立2.3制药微生物生产菌种的建立生产菌的自然分离（出发菌的获取）菌种选育菌种保藏发酵制药生产菌种的建立微生物药物与菌种的筛选流程样品采集微生物分离培养筛选鉴定筛选方法学建立阳性结果化合物分离纯化鉴定前药－新化合物新药研究与开发菌种鉴定与保藏生产出发菌发酵制药生产菌种的建立1、生产菌的自然分离(1)来源：大陆土壤、海洋水体样品的采集：表层土壤（0－10cm），海洋（0－100m）预处理：根据分离目的和微生物的特性。（1）温度；（2）SDS－酵母膏，CaCO3、NaOH处理，减少细菌，有利于放线菌分离；乙酸乙酯、氯仿、苯处理，除去真菌。（3）离心、膜过滤发酵制药生产菌种的建立培养基：选择适宜的培养基，营养和pH；添加抑制剂。分离方法：（1）稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲液（2）滤膜法：0.22－0.45µm。细菌在膜上，放线菌菌丝可穿透，进入培养基。培养条件：温度。放线菌：25－30℃，32－37℃，45－50℃；7－14天至1月。1、生产菌的自然分离(2)发酵制药生产菌种的建立药物的筛选琼脂扩散法——活性测定：非致病菌为对象，筛选生物活性物质。耐药和超敏菌种。HPLC、LC－MS等，分析鉴定活性物质。靶向筛选高通量筛选高内涵筛选发酵制药生产菌种的建立2、菌种选育——自然选育（1）定义：不经过人工诱变处理，根据菌种的自然突变而进行的菌种筛选过程。应用：（1）菌种的提纯复壮。（2）防止退化，稳定生产水平。1年1次。过程菌种单孢子单菌落测活平板分离优良菌株效率低,增产幅度小发酵制药生产菌种的建立2、菌种选育——诱变育种（2）定义：人为创造条件（诱变剂处理），使菌种发生变异，筛选优良个体，淘汰劣质个体。物理类：紫外线，快中子，激光，太空射线。化学类：碱基类似物，嵌合剂，亚硝酸。生物类：噬菌体，转座子。特点：快速，简单，效益大。缺点：无定向性。发酵制药生产菌种的建立诱变方案设计出发菌种的选择：较高产，对诱变剂敏感。诱变剂的使用：交叉使用多种，合理组合。中等剂量（80％致死率）。选择压：施加一定的选择压，获得耐药菌株。措施：添加抗生素，提高前体浓度，增加产物浓度。发酵制药生产菌种的建立诱变育种流程出发菌种单孢子悬液稀释涂板单菌落初筛高产菌株诱变处理稳定性特性放大中试复筛投入生产发酵制药生产菌种的建立2、菌种选育——杂交育种（3）概念：两个不同基因型的菌株，通过结合或原生质体融合，使遗传物质发生重新组合，从中分离筛选出具有优良性状的新菌株。特点：有一定的定向性。种类：体细胞重组接合原生质体融合发酵制药生产菌种的建立（1）体细胞重组殖育种概念：准性生殖范围：放线菌，半知菌纲的真菌过程两条菌丝相互结合重组单倍体二倍体异核体对氟苯丙氨酸产黄青霉：提高青霉素产量灰黄链霉菌：灰黄霉素产量发酵制药生产菌种的建立（2）接合育种概念范围：细菌、放线菌过程：两种细胞混合培养基因片段进入另一细胞重组单倍体合子虽然有成功报导，但多数效果不显著。发酵制药生产菌种的建立（3）原生质体融合育种概念通过生物学、化学或物理学的方法，使两个不同种类的体细胞融合在一起，从而产生具有两个亲本遗传性状的新细胞.发酵制药生产菌种的建立d.筛选，鉴定e.高产菌株a.原生质体制备：用去壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体。操作过程hybridcellc.细胞壁再生b.原生质体融合：异核体或重组子菌株1菌株2去细胞壁原生质体1原生质体2高渗，PEG处理杂合原生质体发酵制药生产菌种的建立2、菌种选育——分子定向育种（4）定向分子育种概念：在分子水平，体外模拟自然进化机制，是突变、重组、选择的重复循环。获得有益突变，淘汰有害突变，使进化向有益的方向发展。发酵制药生产菌种的建立原理与操作过程突变：产生多样性。随机突变，诱变重组：产生新功能。同源重组，非同源重组选择和筛选：表面展示，活性检测野生型随机突变1－2循环，积累有益突变。多轮循环，组合有益突变，消除有害突变。发酵制药生产菌种的建立随机突变获得单个性状优良的菌株多个菌株的原生质体混合、融合、再生，形成第一个融合库（F1）再次重复循环融合，得到融合库F2、F3、F4筛选鉴定基因组shuffling发酵制药生产菌种的建立2、菌种选育——组合生物合成（5）概念：将控制不同产物的生物合成基因进行有矢组合，形成新的基因模块，从而合成新化合物。是基因工程育种的一种发酵制药生产菌种的建立3、菌种保藏原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异，导致退化，从而丧失生产能力甚至菌株死亡。目的：保持菌种原有优良特性，延长生命时限，长期存活、不退化。原理：使菌种代谢处于不活跃状态，即生长繁殖受抑制的休眠状态。措施：物理和化学方法（温度：低温；水分：干燥；氧气：缺氧；营养；缺乏）发酵制药生产菌种的建立低温斜面保藏：低温降低新陈代谢。4℃，RH70％以下。短期保藏，1－6个月；易变异石蜡封存：隔绝氧气，减少蒸发。4℃，约1年。砂土管保藏：干燥抑制生长。孢子吸附在砂土上，真空抽气干燥。干燥器于冰箱，数年。冷冻干燥保藏：保护剂降低菌体细胞冰点，减少冰晶对细胞伤害。低温避光，中期保藏，5～10年。液氮保藏：培养物与冷冻保护剂混合，密封。液氮（－196℃）罐或－80℃冰箱。低温、缺氧、避光和营养缺乏环境。长期保藏。保藏方法发酵制药生产菌种的建立保藏机构－中国中国典型培养物保藏中心:ChinaCenterforTypeCultureCollection(CCTCC)。中国科学院典型培养物保藏委员会,下设9个库中国普通微生物菌种保藏管理中心：ChinaGeneralMi