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未培养微生物和极端微生物的研究进展未培养微生物的研究和应用第一部分•经典分类方法：以形态学及其生化特征分类，不足是不能提供进化和自然的关系；•经典分类的进展：以16SrRNA序列相似性为代表，序列同源性97％以上定义为一个种；•经典培养方法：纯培养方法不足：约有50-100万种原核微生物，目前记载不足5000种经典微生物分类与培养黄石公园ObsidianPool的故事•75~95OC,富含Fe(II)、H2S、H2、CO2Ward采用16SrRNA方法进行了研究，发现同源性只有94.7%Nanoarchaeumequitans—来自冰岛海底热溢口的怪异新古菌•球菌：直径约为400nm•基因组：500kb•与一特异古菌宿主共生•极端嗜热（90℃）•特殊rRNA：古菌中新的一界N.equitansIgnicoccus99%的微生物尚属未知取样环境显微镜计数可培养率（%）土壤1011~1013个/千克0.01~0.1河、湖1011~1013个/升0.01~0.1地下水1011~1013个/升1海洋表层1011~1013个/升0.001~0.1Amann,Ludwig&Schleifer,Microbiol.Rev.59:143(1995)一个“看不见”的事实微生物：–分布最广界定生物圈范围–生物量最大占总生物量的~60%–物种及代谢多样性最为丰富一个重要的认识自然界中已知微生物仅占总数的不到1%。“未知微生物或许是地球上最大的尚未开发的自然资源。”—JamesStanley未培养微生物（unculturedmicroorganisms):无法采用现有常规方法在实验室里培养的微生物。常规方法：•温度范围：10-70℃；•压力范围：常压条件；•pH范围：2-10；•耐盐范围：低盐范围•共同协作的自然生存方式的崩溃互养和共代谢，共栖、互生与共生；•急剧改变的生态位大多数微生物的复苏不仅需要营养物质，还需要提供其群落中的小生态环境，即生态位；1、未培养微生物存在的生态原因•生长环境的极度营养变化对环境资源高亲和性的K型，适应低营养含量和极低的生长率；•潜在外源活性物质的缺乏纯培养很难提供对许多细菌潜在重要的外源活性物质；1、未培养微生物存在的生态原因2.1宏基因组技术基本思路是直接提取环境微生物的总基因组DNA,用核酸内切酶进行部分消化,再与载体连接,转入宿主细胞,构建基因文库，通过筛选文库来寻找目的基因的阳性克隆；•优点：不受已知基因的同源性序列的限制,因而所获得的基因往往结构很新颖；2、未培养微生物的分子生物学研究方法实例Rondon等以细菌人工染色体作为载体构建了两个土壤未培养微生物基因组文库，筛选到41个分别编码脂肪酶、淀粉酶、核酸酶、抗菌、溶血作用等活性的基因，DNA序列与已知序列有很大的差异，其中一个编码的抗菌肽结构属于新的基因家族；传统培养和宏基因组流程比较2.2遗传指纹图谱技术核酸指纹图谱技术即DNA指纹图谱法是1985年由Jeffreys等提出，它是通过用限制性内切酶消化和与特异的核心探针杂交取得不同大小的DNA片段的多点区带图谱，并与另一个DNA图谱比较以评价其相似性的技术。•优点：不受显隐性关系、环境和发育阶段的影响，允许同时进行多样本分析；•缺点：过于依赖内切酶的选用，且方法繁杂、周期长、实验条件高等缺陷而无法大范围推广；•方法：梯度凝胶电泳技术，核酸杂交技术等3.1用低浓度的培养基来进行分离培养一般认为,传统的培养基营养太丰富,不适合于那些原先生长在缺乏营养的环境中的微生物,如海洋微生物；实例1：Connon等用比实验室中常用的培养基营养低3个数量级,小体积、低营养的培养基来分离海洋中的微生物。从11个样品中分离出20500个培养物，其中有4个单细胞系是以前从未培养过、也从未描述过的。通过这种方法，使海洋样品中浮游细菌的可培养率提高到14%，比以前提高了14～1400倍。3、未培养微生物的可培养方法让培养条件尽量模拟成原先的自然状态，如用土壤浸提物和海水滤过液来制作培养基,该方法已趋成熟；实例2：ZenglerK等设计了一个非常精妙的方法，将细胞包埋在凝胶微滴板中，在低营养的流动培养液中进行培养，再用流动血细胞计数法检测微滴板上有多少个微克隆。这是一个开放流动的系统，微生物间的代谢产物及信号分子可在凝胶空隙中进行扩散而被其他菌利用。这与自然环境有很多的相似之处，因而新培养出来的微生物种类也大大增加。这种方法可用于包括土壤和海水的各种环境；3.2根据微生物特性特异添加营养成分变成可培养实例1：Kashefi等根据嗜高热微生物利用Fe(III)作为终端电子受体这一高度保守的特性，在培养基中添加非常微量的Fe(III)氧化物。该方法的前提是对微生物特性有一定的了解。实例2：Santini等从澳大利亚金矿中分出以亚砷酸为电子供体，氧为受体，以CO2为唯一碳源的化能自养菌（NT-26）。16SrDNA序列分析表明，NT-26属于α-Proteobacteria土壤杆菌的一个根瘤菌分支，可能是一新种。环境样品混合基因组DNADNA文库目标基因/基因簇细胞破碎、DNA提取克隆活性筛选同源筛选未培养微生物基因资源的开发—基于培养非依赖（culture-independent）技术的尝试克隆酶生物活性物质PCR1.环境样品DNA的提取和纯化•细胞收集法–Agaroseplug•直接裂解法–物理法：研磨、超声波、冻融、beadbeating–化学法：溶菌酶、ProteinaseK、SDS、酚等DNA提取DNA纯化•CTAB、PVPP•CsCl密度梯度离心、电洗脱、柱层析等2.文库筛选•测序/基因注释•活性筛选–常规活性检测–基于BAC的功能基因组学平台•同源筛选–PCR方法、分子杂交–微排列技术、DNA芯片DNA产量和回收率环境样品粗制DNA产量（g/g）纯化DNA产量（g/g）纯化回收率(%)样品A25.615.561样品B21.34.722样品C3.21.959样品A：微生物所附近的土壤样品样品B：北京造纸七厂排污出口处的土壤样品样品C：云南腾冲温泉样品国内研究实例1王啸波等，微生物学报，2001，41（2）：133-140RestrictiondigestionofthreepurifiedenvironmentalDNAsamples分离自环境样品的纯化DNA的酶切试验Sizedistributionofinsertsinrandomlyselectedclones腾冲热泉试验文库：库容约1Mb；插入片段为3-8kb环境样品DNA文库构建环境样品DNA文库的初步评估——————————————————————————————————————————————————————————————————————————测序样品编号推测可能功能COGCOG功能分类S值E值——————————————————————————————————————————————————————————————————————————9912PeriplasmicproteaseCOG0793M410.0019914RibonucleaseHIICOG0164L295.19915Branched-chainaminoacidCOG0559E279.6ABC-typetransportsystem9916Molecularchaperones,DnaJfamilyCOG0484O426e-049918Protein-disulfideisomerasesDsbC/DsbGCOG1651O648e-119919PeriplasmicproteaseCOG0793M390.003e10DipeptidylaminopeptidasesCOG1506E310.99/acylaminoacyl-peptidasese3UncharacterizedACRCOG1469S311.3e5Uncharacterizedproteins,BmrUfamilyCOG1597S311.00e6Thioredoxinreductase/COG0492O487e-06alkylhydroperoxidereductasee8Anaerobicdehydrogenases,COG0243C365e-101typicallyselenocysteine-containinge9RibosomalproteinS1COG0539J662e-11p10PeriplasmicproteaseCOG0793M293.8p7Anaerobicdehydrogenases,COG0243C352e-110typicallyselenocysteine-containing_______________________________________________________________________________________GeneannotationofpartialDNAsequencesderivedfrominsertsinrandomlyselectedclonesSequencecomparisonbetweenthededucedaminoacidsequenceofanORFand12NADPH-bindingthioredoxinreductasesFADCONSENSUST...G..AAGDMP592PQGFLITNEQ-----METSLKGLFAAGDCRSKHFRQIGTA(266-300)MG102QNGFILGDEN-----MQTNIKGFYVAGDCRSKSFRQIATA(266-300)TrxBN-GYIKVQSGIHGNATQTSIPGVFAAGDVMDHIYRQAITS(261-299)YDR353wEAGYIKTVPG----SSLTSVPGFFAAGDVQDSKYRQAITS(265-300)BS_ahpFRMGEIIVDKH-----GATSVPGLFAAGDCTDSAYNQIIIS(457-491)HI1158N-GYIVVKSGLDGNATATSVEGVFAAGDVMDHNYRQAITS(260-298)jhp0764EYGSIVVDFS-----MKTNVQGLFAAGDIRIFAPKQVVCA(259-293)HP0825EYGSIVVDFS-----MKTNVQGLFAAGDIRIFAPKQVVCA(259-293)MJ1536KKGFIKTDEN-----CRTNIDGIYAVGDVRG-GVMQVAKA(250-283)MTH708KGGYIITDKF-----QRTNVPLVYAAGDITG-GLNQWVTA(252-285)PH1426EYGYIPVDMY-----MRTKVPGIFAAGDITN-VFKQIAVA(279-312)TM0869PYGYVITDEN-----METSVKGIYAVGDVRKKNLRQIVTA(267-301)e6GLGNLIVDSQ-----QRTAISGLYAIGDIVN-EINQLAVA(125-158)MP592，Mycoplasmapneumoniae；MG102，Mycoplasmagenitalium；trxB，Escherichiacoli；YDR353w，Saccharomycescerevisiae；BS_ahpF，Bacillussubtilis；HI1158，Haemophilusinfluenzae；jhp0764，HelicobacterpyloriJ99；HP0825，Helicobacterpylori；MJ1536，Methanococcusjannaschii；MTH708，Methanobacteriumthermoautotrophicum；PH1426，Pyrococcushorikoshii；TM0869，Thermotogamaritima20个随机克隆插入片段12个可预测功能开放阅读框序列均未见报道研究