2固定化酶

1一、什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术第二章固定化酶2二、固定化酶的特点优点：–不溶于水，易于与产物分离；–可反复使用；–可装塔连续化生产；–稳定性好。缺点：-固定化过程中往往会引起酶的失活-首次投入成本高-大分子底物较困难3•（一）吸附法•（二）结合法•（三）交联法•（四）包埋法三、固定化酶的方法4（一）吸附法•物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。选择载体的原则:-要有巨大的比表面积-要有活泼的表面-便于装柱进行连续反应物理吸附法:-静止法-电沉积法-反应器上直接吸附法-混合浴或振荡浴吸附法5优点：固定化时酶分子的构象很少或基本不发生变化。缺点：结合力弱，易解吸附。载体：纤维素、琼脂糖、活性炭、沸石及硅胶等。6（二）结合法•1离子键结合法•2共价键结合法71离子键结合法•酶分子含有离子交换基团的固相载体•第一个离子结合法固定化酶：•DEAE—Cellulose•固定化过氧化氢酶•第一个工业化的固定化酶：•DEAE-SephadexA-50•固定化氨基酰化酶•常用载体:DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶•使用注意：pH、离子强度、温度82共价键结合法•（1）概念•（2）可以形成共价键的基团：游离氨基，游离羧基，巯基，咪唑基，酚基，羟基，甲硫基，吲哚基，二硫键•（3）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体9共价键结合法制备固定化酶的“通式”•首先载体上引进活泼基团••然后活化该活泼基团•最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键10（4）载体活化的方法•A．重氮法(需载体具有芳香族氨基)•B．叠氮法•C．烷基化反应法•D．硅烷化法•E．溴化氰法11（三）交联法•交联法:借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。•常用试剂:戊二醛、异氰酸酯、N，N’乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛。12双功能试剂：常用的是戊二醛OOH—C—CH2—CH2—CH2—C—H第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间交联的固定化酶戊二醛的两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱(shiff)。13图酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联•酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶。14•交联法有2种形式：酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。酶辅助蛋白交联：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个载体蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。15双重固定法：（1）吸附交联法•先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。16（2）交联包埋法•把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。17（四）包埋法（entrappingmethod）定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中使酶固定化的方法。分为：网格型和微囊型181．网格型•将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶的方法。也称为凝胶包埋法。192．微囊型包埋法•将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。20各类固定化方法的特点比较:比较项目吸附法结合法交联法包埋法物理吸附.共价键结合离子键结合制备难易易难易较难较难固定化程度弱强中等强强活力回收率较高低高中等高载体再生可能不可能可能不可能不可能费用低高低中等低底物专一性不变可变不变可变不变适用性酶源多较广广泛较广小分子底物、药用酶21固定化后酶的考察项目：•（1）测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率。•（2）考察固定化酶稳定性。•（3）考察固定化酶最适反应条件。22•1.固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。•或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。•2.操作半衰期：衡量稳定性的指标。连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）评价固定化酶的指标:23•3.•4.•或称偶联效率，活力保留百分数。•5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。•24四、影响固定化酶性质的因素1．酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。2．载体的影响•（1）分配效应•（2）空间障碍效应•（3）扩散限制效应3.固定化方法的影响25五、固定化后酶性质的变化•1．固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降•原因：酶结构的变化•空间位阻262．固定化对酶稳定性的影响•（1）操作稳定性提高。•（2）贮存稳定性比游离酶大多数提高。•（3）对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。•（4）对分解酶的稳定性提高。•（5）对变性剂的耐受力升高。27固定化后酶稳定性提高的原因：•a.固定化后酶分子与载体多点连接。•b.酶活力的释放是缓慢的。•c.抑制自降解，提高了酶稳定性。283．pH的变化•PH对酶活性的影响：•（1）改变酶的空间构象•（2）影响酶的催化基团的解离•（3）影响酶的结合基团的解离•（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。29pH对固定化酶的影响•1）载体带负电荷，pH向碱性方向移动。•微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。30•2）载体带正电荷，pH向酸性方向移动。•3）产物性质对体系pH的影响•催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高；反之则低。314．最适温度变化•一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。•5．底物特异性变化•作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化•既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶特异性往往会变化。326．米氏常数Km的变化Km值随载体性质变化•（1）载体与底物带相同电荷，Km’Km固定化酶降低了酶的亲和力。•（2）载体与底物电荷相反，静电作用，Km'Km33六、固定化酶（细胞）的应用•1.固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用•2．固定化酶在医药治疗上的应用•3．固定化酶在分析化学中应用•4．固定化酶和亲和色谱•5．固定化酶与环境保护•6．新能源开发中的应用•7．固定化酶在基础理论研究中应用341．固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用•葡萄糖异构酶——世界上生产规模最大的一种固定化酶。•利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶•固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类•热点：固定化原生质体的应用352．固定化酶在医药治疗上的应用•例1•固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就可以生成不同的产物。36青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素OH2NR2R1NH2NSOOOHNR1NH2NSOOOOHH1:D-(-)-PGA(R1=H,R2=NH2)2:D-(-)-PGM(RI=H,R2=OMe)3.D-(-)-HPGA(R1=OH,R2=NH2)4:D-(-)-HPGM(R1=H,R2=OMeH2OPenicillinGacylase+Ampicillin(RI=H)Amoxicillin(R1=OH)7-ACAasnucleus37青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素R2R1NH2NSNNSR3R1OOOOOOH2NNH2OHR3HOH+PenicillinGacylaseH2O7-ACCA(R3=Cl)7-ADCA(R3=Me)Cefaclor(R1=H,R3=Cl)Cephalexin(R1=H,R3=Me)Cefadroxil(R1=OH,R3=Me)7-ACCAor7-ADCAasnucleus38•例2：制造人工肾•利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的体外循环装置，大大提高了疗效。393．固定化酶在分析化学中应用•酶柱和酶管，可与分光光度计、荧光计或电量计结合，形成酶电极，进行某些物质的自动分析。40酶电极221,5DODHO葡萄糖葡萄糖内酯41酶电极•特点：快速、方便、灵敏、精确•范围：糖类、抗生素、氨基酸、甾体化合物、有机酸、脂粉、醇类、胺类以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等•要求：酶必须有较强的专一性，并且要有一定的纯度。424．固定化酶和亲和色谱•亲和技术的基础：是生物活性化合物生物特异信息的综合。•利用了生命现象中生物分子间特有的高亲和力、高专一性，可逆结合而设计的纯化方法。•是唯一能够体现待分离物质间生物学功能差异的分离方法。435．固定化酶与环境保护•一、环境监测•二、污染物处理446．新能源开发中的应用•H2是重要的能源物质，虽然有许多微生物可以产生H2，但产氢系统不稳定。有人利用固定化丁酸梭菌连续产氢，稳定性比天然细胞好。•将植物的叶绿体中的铁氧还原蛋白氧化酶系统用胶原膜包被，可用于水的光介产生氢气和氧气。457．固定化酶在基础理论研究中应用•阐明酶反应机理•揭示酶原激活机理46酶亚基性质的研究47研究蛋白质-核酸分子结构•连续的固定化酶柱进行DNA序列分析；•原理：是测定DNA聚合时，以掺入dNTP同时释放的焦磷酸判断是否发生了聚合反应，进而确定掺入的是哪种核苷酸从而推导出序列；•——该系统由连续的6个固定化酶柱组成•焦磷酸酶、DNA聚合酶、甘油激酶、己糖激酶、ATP磷酸化酶，荧光酶柱。48