第五讲-1 中药含量测定方法-n1

第五讲中药含量测定方法（DeterminationofTraditionalChineseMedicine）★含量测定的定义和意义中药制剂的含量测定是指用适当的化学方法或仪器分析方法对制剂中某种（些）有效成分或有效部位进行的定量分析。并以其测定结果是否符合药品标准的规定来判断药品的优劣，是控制和评价药品质量的重要方法。★含量测定方法中药制剂含量测定的方法包括化学分析法和仪器分析法两大类。由于中药制剂组成复杂，仪器分析法更为常用。《中国药典》中药制剂含量测定方法概况见下表。★本章重点介绍TLCS、HPLC、GC、HPCE、挥发油测定法、分光光度法、浸出物测定法、容量分析、重量分析。327456总计213浸出物测定法03挥发油测定法15氮测定法15重量法313滴定法化学分析法318分光光度法1923GC1232TLCS282339HPLC仪器分析法新增应用品种数方法2005年版《中国药典》中成药含量测定方法概况一、薄层色谱法实验仪器CAMAGLinomat5半自动点样仪CAMAGScanner3薄层色谱扫描仪CAMAG数码摄像系统甘草（Licorice)种类：乌拉尔甘草（Glycyrrhizaura。Fis。）胀果甘草（GlycyrrhizainflataBat.）光果甘草(GlycyrrhizaglabraL.)药效:补脾益气、解毒保肝、润肺止咳、调和诸药。化学成分:皂苷类（甘草酸）、黄酮类（甘草苷）、香豆素类、氨基酸和多糖类化合物。甘草根甘草的硅胶薄层扫描指纹图谱(SG-TLCS-FP),fingerprint甘草药材的TLCS-FP图14批样品的TLCS-3D-FPTLCS-3D-FP在监控药材质量方面的应用聚酰胺薄层指纹图谱（PA-TLCS-FP)甘草聚酰胺薄层扫描图谱1、概述（1）薄层色谱法的特点•设备简单，操作方便。•广泛地选用各流动相，比气相色谱灵活。•灵敏度较高•薄层色谱法适于分析小量样品•可以采用多种展开方式：如，双向展开，多次展开，分步展开，连续展开；分离原理是的物理化学原理，例如，吸附色谱，分配色谱，离于交换，薄层电泳，薄层等电聚焦。适于分析热不稳定，难挥发的样品。（2）方法原理　　原理：薄层色谱分离法是将固定相吸附剂均匀地涂在玻璃上制成薄层板，试样中的各组分在固定相和作为展开剂的流动相之间不断地发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配过程。不同物质上升的距离不一样而形成相互分开的斑点从而达到分离。（3）固定相•　（1）硅胶：微酸性极性固定相，适用于酸性、中性物质分离（可以制备成酸度不同或碱性硅胶扩大使用范围）•　（2）氧化铝：碱性极性固定相，适用于碱性、中性物质分离（可以制备成中性或酸性氧化铝扩大使用范围）•　（3）聚酰胺：含有酰胺基极性固定相，适用于酚类、醇类化合物的分离•　（4）纤维素：含有羟基的极性固定相，适用于分离亲水性物质2、方法一：薄层色谱-可见分光光度法•1）点样：条状，50－300ul•2）定位：对照的位置，区带的范围–紫外、荧光、碘蒸气、对照品定位、紫外扫描•3）捕集：•4）洗脱：类似柱色谱–渗漉、多次浸出、加热温浸、索氏回流提取–荧光板应洗脱后再比色•5）显色及比色–显色剂用量–反应时间、反应温度–显色稳定性–空白试剂及固定相最好不显色Off-line3、方法2：薄层色谱-紫外分光光度法•不需加显色剂•其他同薄层色谱-可见分光光度法Off-line4、薄层色谱扫描法（ThinLayerChromatographyScanTLCS）1）、定义薄层扫描法（TLCS）系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分值用于药品定性定量分析的方法。2）、特点具有分离分析双重功能。与高效液相色谱法比较，具有多通道效应，可同时平行分离分析多个样品；流动相用量少且选择范围宽、更换方便；固定相为一次性使用，对样品的预处理要求不高等优点。在中药及其制剂检验中，是重要的分析方法。《中国药典》中有32个中成药品种采用该法进行含量测定。Off-line1.薄层扫描仪中国药典采用双波长薄层扫描仪。常用的有岛津CS-930型和CAMAG-Ⅱ型等。2.扫描仪工作原理3）、仪器及其工作原理（1）吸收法适用于有紫外（可见）吸收的成分，较常用。该法又可采用反射法或透射法测定。理论上讲，透射法比反射法优越，但实际工作中常用反射法，因为紫外光不能通过玻板。（2）荧光法适用于有荧光性质的成分，例如小檗碱等。该法仅采用反射法测定，其灵敏度比吸收法高。4）测定方式5）测定波长（1）单波长一般用于荧光测定法，即用某一波长的紫外光（激发光）进行扫描。对玻板和斑点的质量要求较高。（2）双波长主要用于吸收测定法。该法可消除背景干扰，对玻板和斑点的质量要求不高，故较常用。测定时，样品波长（λs）和参比波长（λR）依次扫描斑点，所测吸收度为ΔA=Aλs－AλR。样品波长（λs）：即被测成分的λmax参比波长（λR）：即被测成分的λmin或此波长处无吸收。（1）直线扫描适用于规则的斑点，仅用于荧光测定法。（2）锯齿扫描适用于不规则的斑点，测量误差小，被测成分积分值重现性好，故吸收测定法常用此扫描方式。6）光束扫描方式7)光源（1）钨灯（W）：供可见光（350～800nm）测定，扫描有色成分的斑点。（2）氘灯（D2）：供紫外光（200～400nm）测定，扫描有紫外吸收的成分斑点。（3）氙灯（Xe）：供荧光测定，发射不连续光谱，常用波长为365nm。TLCS含量测定有外标法和内标法，中国药典仅采用外标法。a)原理外标法系将一定量的供试品溶液和对照品溶液分别点加在同一块薄层板上，展开，显色，定位，扫描被测成分和对照品斑点，测得相应的吸收度或荧光强度积分值，根据定量关系，计算出被测成分的含量。b)类型根据对照品标准曲线性质的不同，外标法又分为外标一点法和外标两点法。若标准曲线通过原点，采用外标一点法。若标准曲线不通过原点，采用外标两点法。8)含量测定方法（外标法）外标一点法的直线方程：C=FAF为斜率外标两点法的直线方程：21FAFC、12121AACCF1221122AACACAFF1为斜率F2为截距【说明】在根据药品标准测定样品时，并不需要做标准曲线，按照药品标准规定执行即可。当然，测试者应能从中明确该测定是外标一点法还是外标两点法。c)操作步骤（1）对照品溶液的制备（2）供试品溶液的制备（3）点样一般要求使用市售薄层板。①外标一点法：至少6个原点对照品（R）2个（同一质量）：2R供试品（S）4个（同一质量）分2组：2S12S2②外标两点法：至少8个原点对照品（R）4个分2组大质量的2个：2R1小质量的2个：2R2供试品（S）4个（同一质量）分2组：2S12S2对照品与供试品应交叉点加在同一块薄层板上，目的在于消除各种误差。测定时应保证供试品原点的量在线性范围内，必要时可适当调整供试品溶液的点样量。外标两点法外标一点法（4）展开（5）显色定位供试品色谱中待测斑点的比移值（Rf值）和光谱扫描得到的吸收光谱最大吸收与最小吸收应与对照品相符，以保证测定结果的准确性。（6）扫描应沿展开方向扫描，不得横向扫描。（7）含量计算①外标一点法▲求出供试品被测成分（斑点）的质量Ms=MRXAsARMs被测成分的质量（Mn=2）MR被测对照品的质量As被测成分吸收度（荧光强度）积分值（An=2）AR被测对照品吸收度（荧光强度）积分值（An=2）___▲求出供试品中被测成分的含量含量（W/W）=MsX稀释倍数取样量含量（W/片）=MsX稀释倍数X平均片重取样量②外标两点法▲求出供试品斑点中被测成分的质量Ms=•C+V1C(V2-V1)(A-A1)(A2-A1)Ms被测成分的质量（mgn=2）A1对照品小点样量吸收度（荧光强度）V1对照品小点样量（μl）积分值（An=2）V2对照品大点样量（μl）A2对照品大点样量吸收度（荧光强度）A被测成分吸收度（荧光强度）积分值（An=2）积分值（An=2）C对照液的浓度（mg/ml）____9)应用实例1.九分散中士的宁的含量测定九分散是由马钱子粉、麻黄、乳香和没药等制成。马钱子粉中含有士的宁、番木鳖碱等生物碱，具生理活性但也有毒性，故需控制马钱子含量。中国药典规定按干燥品计每包含马钱子以士的宁计应为4.5～5.5mg。供试品溶液的制备取本品10包，混合研匀。精密称取2g置具塞锥形瓶中，精密加氯仿20ml与浓氨试液1ml，轻轻摇匀，称重，于室温下放置24小时，再称重，补足氯仿减失的重量，充分振摇，滤过。精密量取滤液10ml，用硫酸溶液（3→300）分次提取，至生物碱提尽，合并硫酸液，置另一分液漏斗中，加浓氨试液使呈碱性，用氯仿分次提取，合并氯仿液，蒸干，放冷，残渣中精密加氯仿5ml使溶解，作为供试品溶液。对照品溶液的制备取士的宁对照品，加氯仿制成每1ml含0.4mg的溶液，作为对照品溶液。测定法吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-丙酮-乙醇-浓氨试液。（16∶12∶1∶4）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。照薄层色谱法进行扫描，波长：λs=254nm，λR=325nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。已知：AR＝19663.07，As＝20617.25，取样量2.098g。解答问题：①采用外标一点法还是外标两点法？②采用什么方法显色定位？③计算每包药品中马钱子的含量。（保留两位有效数字）①求出供试品斑点中士的宁的质量②求出供试品中士的宁的含量Ms=MRX=5μlx0.4μg/μlx=2.1μgAsAR19663.0720617.25含量（mg/包）=MsX稀释倍数X标示重量取样量=0.0021mgX5mlX20mlX2.5g/包0.005mlX10mlX2.098g=5.0（mg/包）本品系由枳实、大黄和黄连等八味药材制成的水丸。中国药典规定按干燥品计算，每1g含枳实以橙皮苷（C28H34O15）计，不得少于20.0mg。供试品溶液的制备取本品粉末（过三号筛）约0.5g，精密称定（0.5124g），置索氏提取器中，加甲醇90ml，加热回流4小时，趁热滤过至100ml量瓶中，用少量甲醇洗涤容器，洗液与滤液合并，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取5ml，置250ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。对照品溶液的制备精密称取橙皮苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，作为对照品溶液。2.枳实导滞丸中橙皮苷的含量测定测定法精密吸取供试品溶液5μl、对照品溶液2μl与5μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇为展开剂，展开，展距约3cm，取出，晾干，喷以1％三氯化铝的甲醇溶液，放置3小时，在紫外光灯(365nm)下定位。上机进行荧光扫描，激发波长：330nm,线性扫描，测量供试品与对照品荧光强度的积分值［AR(2μl)=885.7AR(5μl)=979.4AS=835.6］，计算，即得。说明：①聚酰胺TLC分离黄酮类成分效果较好故选之。②橙皮苷与AlCl3反应显色，在330nm紫外光下发射较强的绿色荧光（波长：500nm）。•①本法采用的是吸收测定法还是荧光测定法？外标一点法还是外标两点法？透射法还是反射法？直线扫描还是锯齿扫描？光源是什么？•②求算枳实（橙皮苷）的含量（保留三位有效数字），并判断是否符合药典规定回答问题：(V2-V1)(A-A1)(A2-A1)含量计算①求算出斑点中橙皮苷的质量Ms=•C+V1C=•0.05mg/ml+2ul•0.05mg/ml(979.4－885.7)(5ul－2ul)(835.6－885.7)=0.0198ug(1.98X10mg)②求算出枳实（橙皮苷）在药品中的含量含量（mg/g）=MsX稀释倍数取样量=-51.98X10mgX2.5X10ulX1.0X10ul-5555ulX5X10ulX0.5124g3=38.6薄层扫描法测定荷叶中荷叶碱的含量•CAMAGTLCSCANNER3薄层扫描仪(瑞士CAMAG公司);