第五章 基因组学与蛋白质组学

第五章基因组学与蛋白质组学基因组（genome)是指一个物种的单倍体的染色体数目，又称染色体组。它包含了该物种自身的所有基因。基因组学（genomic)是指对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录图谱）、核酸序列测定、基因定位和基因功能分析的科学。包括结构基因组（structuralgenomic)和功能基因组（functionalgenomic)5.1基因组学的概念寻找致病基因的过程及与四张图谱的关系5.2.1遗传图谱(连锁图谱):基因组内基因及专一的多态性DNA标记相对位置的图谱,是根据DNA重组原理用遗传学距离来排定在染色体上的相对位置。通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率,用厘摩(centimorgan,cM)来表示1cM概念即每次减数分裂的重组频率为1%,重组率代表两基因间的距离,距离越近,两个基因连锁越紧密,重组率越小人类基因组平均遗传长度为3300cM,细胞遗传学研究表明:在产生一个种系细胞的减数分裂过程中,平均的交换次数为33次,而人类DNA物理长度大约为30亿个碱基对,据此推测1cM约等于1,000,000碱基对的物理长度5.2基因组学的图谱第一代标记:限制性片段长度多态性(RFLP)RFLP是指不同个体基因组内的核苷酸序列因某种原因产生碱基突变后，改变了某种限制性内切酶的剪切位点，使此酶在该位点不能剪切，形成了长度不等的限制性片段。这些限制性片段在不同个体间呈现的多态RFLP的特点：在基因组研究和基因定位克隆应用中具有重要价值。可在遗传图谱和物理图谱之间起桥梁作用，又可以作为致病基因的连锁标记，确定致病基因与标记的位置和连锁关系，寻找致病基因遗传图谱的发展产生机制：DNA复制或修复过程中，碱基错配导致一个或几个重复单位的缺失或插入。MS的特点：分类多、分布广泛、高度多态性、杂合性高、重组率低、信息含量多第二代标记:微卫星DNA(microsatelliteDNA,MS)或短串联重复序列(STR):由1-6bp个碱基组成的串联重复序列,由于其重复单位短小,又可以叫做简单序列DNA最常见的是双核苷酸重复,即(CA)n和(TG)n,n可以是10-60,多位于基因的内含子或非翻译区等非编码渠内，其高度多态性多来源于串联数目的不同第三代标记：单核苷酸多态性（SNP）：指不同个体基因组DNA序列中同一位置上的单个核苷酸的差异，差异在群体中所占比例均大于1%，就人类基因组而言，大约每1000bp就有一个SNP，那么整个基因组可能有300万个SNP位点SNP的分类：一类是位于基因编码序列、决定蛋白质结构和功能的SNP，称为互补SNP(complementarySNP,cSNP)；另一类是位于基因调控序列中的单核苷酸多态性，称为SNP。MS的应用：可绘制高分辨率的遗传连锁图，并为基因组全序列测定及基因分离奠定基础，也可以是物理图的标志，促进了遗传图和物理图的整合SNP的优越性：a、位点丰富，在基因组中具有较大的覆盖率，覆盖密度可达1%；b、用DNA芯片及微阵列技术可对上万个SNP进行分型分析，分析量大，可弥补凝胶分析手段的不足；c、可选择具有群体特异性的SNP进行关联分析，有助于确定染色体狭窄区段内是否存在靶基因。SNP的应用：连锁分析、疾病关联分析、多基因疾病的基因定位、发病机理、个体识别及亲子鉴定、生物进化关系的研究等5.2.2物理图谱是把遗传图谱中克隆群上的DNA片段按实际的物理距离（Mb，kb，bp）进行排序所构建的图谱。1、染色体图谱（细胞遗传图谱）：用原位杂交或荧光原位杂交FISH技术确定DNA片段在染色体上的区带位置2、长片段限制性酶切图谱：表明DNA分子上的限制位点、数目、限制片段大小及排列顺序的图谱3、DNA克隆片段重叠群图：是一组带有外源DNA的载体叠连群。这组克隆了外源DNA片段的载体可通过末端重叠序列相互连接成连续的DNA片段，确定出重叠DNA片段克隆的顺序和距离。4、基于STS的物理图谱A、序列标签位点（sequencedtaggedsite，STS）一段约200-300bp的特定DNA序列，每个STS序列位点对应于基因组中一个单独的位置。来源于EST序列、随机测序等B、表达序列标签（expressedsequencesite，EST）随机选取cDNA克隆的部分（末端）序列，即一个EST对应于某一种mRNA的一个cDNA克隆的一段序列，一般长度为300-500bp，经一定方法定位后转变为STS。EST的应用：全长基因的克隆（构建重叠群）、基因定位、基因表达、基因结构分析物理图谱的特点：可把遗传学信息和物理信息进行互相转换，片段重叠群则为研究该区域提供了可操作的基因组材料，得到相互重、覆盖的DNA片段，可在这一区域寻找某一基因。C、STS含量图中，STS标记物通过PCR监测，插入克隆基因库（YACs或BACs），如果两个或两个以上的克隆包含相同的STS，那么这些片段紧密相邻的机会就会很高片段克隆群（连续克隆群，contig）：为搞清某片段DNA的排列顺序而建立的一组克隆，被克隆的DNA小片段有相互邻接并部分重叠的关系，从而可完全覆盖该段DNA，一个这样的克隆群即为一个contig5.2.3转录图谱转录图谱又称表达图谱、基因图谱、外显子图谱。(据报道，在人类基因中，通常仅有3%-5%的基因得以表达。)所有的蛋白质均由mRNA编码，把mRNA通过反转录酶合成cDNA，再用稳定的cDNA或EST片段做探针进行分子杂交，鉴别出与转录有关的基因。由EST绘制的图谱称为转录图谱。转录图谱的意义：能有效的反映在正常或受控条件中表达的全基因的时空图，可了解某一基因在不同时间不同组织不同水平的表达测序：末端双脱氧终止反应序列分析功能分析（1）蛋白质组：指基因组表达的所有相应的蛋白质，也可说是指细胞或机体全部蛋白质的存在及其活动方式。（2）蛋白质组学：研究细胞内全部蛋白质的组成及其活动规律的科学。5.3蛋白质组与蛋白质组学5.3.1蛋白质组特点---多样性和可变性（1）蛋白质的种类和数量在同一机体的不同细胞中是各不相同的。（2）同一细胞，在不同时期、不同条件下，蛋白质组也是在不断改变的。（3）在病理或治疗过程中，细胞蛋白质的组成及其变化与正常生理过程也不同。1.研究细胞或组织内蛋白质表达模式的技术：2-D电泳1975年，PatrickOˊFarrel发明了二维凝胶电泳。操作（1）等电聚焦。（2）平衡胶条。（3）第二相SDS-PAGE。5.3.2蛋白质组研究的相关技术2-D胶上蛋白质鉴定（1）早期Westernblot鉴定（2）Edman降解法鉴定（3）肽质量指纹（peptide-massfingerprinting）技术鉴定（4）蛋白质组信息学2.蛋白质序列测定肽序列分析的基本步骤：（1）分析已纯化蛋白质氨基酸残基的组成。（2）测定头尾氨基酸。（3）把肽链水解成片段，分别进行分析，得到肽图。（4）Edman降解3.研究蛋白质胞内分布及移位的方法4.研究蛋白质功能模式的技术酵母双杂交系统、选择性噬菌体感染技术、质谱技术可用于确定蛋白质作用区域。1.用于寻找疾病相关的蛋白质：标志物。2.用于微生物蛋白质组研究，彻底阐明病原微生物的致病机理并寻找全新的药物作用靶点。3.蛋白质组数据库将成为药物设计的路标。4.对不同生物的蛋白质组进行比较性研究，可以对生物进化途径提供参考，对多细胞生物的起源提供线索。5.追踪胞内信号分子的移位，阐明目标蛋白质在信号转导途径中的位置。5.3.3蛋白质组学研究的应用1.2-D电泳胶上的点只是细胞蛋白质中的一小部分，大部分不能被显示。2.2-D胶上显示的蛋白质有偏向性。3.难溶于水或分子量大于18万的蛋白质难于在2-D胶上显示。4.质谱技术虽有较高的灵敏度，但对来自2-D胶上的许多低丰度的蛋白质仍不能鉴定。五、蛋白质组学研究中局限性