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工业微生物的分离与筛选第一节微生物的自然分布第二节产生抗生素菌株的来源第三节工业微生物的常规分离第四节有用微生物的筛选第一节微生物的自然分布一土壤中的微生物二水域中的微生物三空气中的微生物四极端环境中的微生物一土壤中的微生物◆1种类依据在土壤中的数量多少：细菌、放线菌、真菌、藻类、原生动物、病毒◆2数量大约107～108个/克——在固体培养基上生长发育的菌数。用显微镜直接观察要高3～4倍到102～103倍土壤中大量微生物已成为分离各种抗生素、生理活性物质、酶和氨基酸产生菌的主要来源原因：可以培养的微生物未生长。发育慢或要求特别营养。因此需进行特别培养纯种分离研究其性质。二水域中的微生物水环境：地球的70%左右由水覆盖，其中溶解和悬浮有机、无机物，流动水有氧渗入可供微生物生长。微生物种类：水中有机物含量多少决定微生物种类。微生物数量：海水中菌数因深度不同有变化。深度增加菌数减少。应用：从海水中分离产生新抗生素、生理活性物质菌株。污水中的活性污泥是重要有用微生物的来源。三空气中的微生物环境：不利于微生物生长，所以无固定种类。种类分布：主要是真菌和细菌，在医院，公共场所致病菌的数量多。作用：可迅速全球传播，对地球上生物繁衍有一定意义。四极端环境中的微生物极端环境：高等动植物不能生长，大多数微生物不能生活的高温、低温、强碱、强酸、高盐、高压、高辐射、等特殊环境。◆1种类：极端嗜热菌，最适生长温度90～105℃，高达110℃极端嗜冷菌，可在零下70～80摄氏度度生长。极端嗜盐菌，新疆盐湖中的可耐受20～30％的NaCl极端嗜碱菌，PH9～10极端嗜压菌，在深海底，生活压力7.1～8.1×107Pa◆3应用开采石油：嗜压菌产气增压降低原油粘度。生产特殊酶制剂：嗜碱细菌产生的蛋白酶作为洗涤剂的添加剂环境保护：嗜碱芽孢杆菌产生的木聚糖酶能够水解木聚糖产生木糖和寡聚糖，可用来处理人造纤维废物遗传工程以及基因技术：从水生栖热菌中提取耐热的TaqDNA聚合酶◆2特性都为古细菌。具有不同于一般微生物底遗传机制、特殊底细胞结构和生理功能。第二节产生抗生素菌株的来源产生抗生素的菌株主要来源于土壤，可在不同的环境（高山、平原、河川、深海、旱地）采集挖掘样品分离筛选。放线菌细菌霉菌担子菌一放线菌◆1链霉菌40年代Waksman发现链霉素。从土壤简单分离。在5000个以上的抗生素菌种中，有50％来自放线菌。其中从土壤样品中分离出来的放线菌中链霉菌属约占90～95％。是分离探索多种新抗生素、新生理活性物质产生菌的主要来源一放线菌◆2稀有放线菌Rareactinomycetes稀有放线菌：链霉菌以外的放线菌。如小单胞菌、诺卡氏菌、游动放线菌、链孢囊菌、糖多孢菌。不易形成孢子。少见。常规培养基不能分离。需对不同来源的样品做预处理。如分离游动放线菌：将混浊土壤水样倾入培养皿中，后接入花粉进行培养。或采用加温处理。放线菌产生的主要抗生素链霉菌稀有放线菌氨基糖苷类氯霉素链霉素环丝氨酸林可霉素新生霉素小单胞菌氨基糖苷类大环内酯类肽类游动放线菌缩酚肽类肽类多烯类诺卡氏菌氨基糖苷类氯霉素链孢囊菌氨基糖苷类优胜霉素普拉克托霉素二细菌◆1细菌种类：芽孢杆菌属，假单胞菌属◆3提取的优缺点培养时间短，对生产有利。但：※易受到噬菌体的侵袭※易产生粘性强的多糖类◆2产生的抗生素种类:杆菌肽、短杆菌肽、泰乐菌素、粘菌素、多粘菌素E、多肽类10多种已在临床应用。——防治污染——采用变异菌株三霉菌1产生的抗生素青霉素G、青霉素O、青霉素V、头孢菌素、灰黄霉素、赤霉素、烟曲霉素、黄青霉素等。可作为筛选放线菌代谢产物的补充。2产生的其它物质生理活性物质——木霉生产免疫抑制剂环孢菌素维生素——棉病囊霉生产核黄素三顶孢霉生产维生素甲原。四担子菌分离的抗生素能抗肿瘤、加强免疫——革兰菌素、小奥得酮、优灵多糖、云芝多糖、竹黄多糖第三节工业微生物的常规分离对工业微生物的基本要求及其分离途径从自然界分离微生物的常规方法一对工业微生物的基本要求微生物菌株是发酵生产成败的关键。1菌株应为“纯种培养”。镜检无其它微生物。且无噬菌体感染。2菌种具稳定的遗传性。3必须能生长出可再生的单位——营养细胞孢子4种子质量好——各级种子罐的扩大培养要生长迅速、强健。有用微生物必须具备的特性5在短时间内可获得目的产物——3天或更短。6菌株的自我保护及采取措施——降低PH高温生长加入选择性抑制剂。7目的产物多，且在多组分中易分离。有用微生物必须具备的特性二从自然界分离微生物的常规方法1分离培养微生物的常规操作2采样分离方法3微生物的接种培养方法4纯化分离菌种的方法5原生动物和藻类的分离培养1分离培养微生物的常规操作分离——从存在于自然界的混合菌群里分离出一种微生物，并加以培养。分离研究微生物要在无菌条件下进行。防杂菌污染包括：（1）操作在无菌室、无菌箱、超净工作台上进行。使用前用70～75％酒精棉球擦拭。（2）培养容器（试管、培养皿）要事先灭菌。培养时要加盖。以防污染。（3）接种用具（吸管、接种环）要灭菌（4）接种时塞子或盖要在火焰上过一下。2采样分离方法（1）从自然界采样分离培养分离挖土稀释接种——表面向下5cm，编号记录——1000～100万倍——取0.1～0.2ml稀释液——选用易生长发育的培养基2采样分离方法（2）从检样分离从检样直接分离菌株时，可采取下列方法的任何一种。A把检样土直接混合到预先融化的固体培养基中培养。B取稀释后检样的上清液混合到固体培养基中。C把上清液接入液体培养基中培养一定时间再接入固体培养基。D将土样连续几次在液体培养基中富集培养后，接入固体培养基中分离。3微生物的接种培养方法（3）稀释平板培养法（定性、定量）加上下面的辅助措施主要适用于厌氧菌的分离培养对绝对厌氧菌的辅助措施培养用培养箱要预先去除氧并密闭3微生物的接种培养方法（4）厌氧菌的稀释转动分离培养法将琼脂试管加热溶解冷却至50℃（保持液态），接种一支试管，转动混合后取出1/10接入第二支试管，转动混合后再取出1/10接入第三支试管，依次类推，连续接种6～10支。冷却凝固。在琼脂培养基表面倾注一层无菌石蜡，防止空气中的氧气进入。4纯化分离菌种的方法挑取首批菌落菌悬液无菌稀释液稀释接种到培养皿培养重复上述步骤单孢子分离稀释转动培养——挑取一个菌落——取一部分——观察。必要时所有操作在无菌条件下进行5原生动物和藻类的分离培养单细胞分离：用显微镜或解剖镜观察控制，从微生物群体中分离出单一种类的微生物个体。方法：在无菌液体培养基中采用稀释法分离。取细长吸液管，从菌群中吸取个体原生动物或藻类要求：熟练的操作技术第四节有用微生物的筛选筛选：从自然界某些含有菌群的材料中，用特定的操作程序分离并发现有用的微生物。筛选有用微生物是工业生产过程的第一步。一供筛选分离样品（采样）的来源二初筛三复筛四抗菌谱的测定一供筛选分离样品（采样）的来源1自然资源分离筛选土壤采样分离。最理想是山野、农田、沼泽、湖泊、海洋考虑不同民俗、动植物生态。2已有菌株包括保藏的菌株。变异处理得到新的菌株。二初筛（一）目的：得到具有潜在应用价值的目的微生物。初筛一次或多次从现有菌群中把多数无用的微生物淘汰，把少量有用的微生物筛选出来。（二）要求：快速——有预测或预见敏捷——迅速处理好众多的样品。经济——得到有广泛目标的有用微生物。二初筛（三）筛选方法琼脂平板培养基上培养生产出群体后初筛。1用PH指示剂检测有无有机酸或胺类。中性麝香草酚蓝:PH＜6.0黄,PH＞7.6蓝,PH6.0~7.0绿2在培养基中加入碳酸钙检测有机酸。可在菌群周围形成清晰的碳酸钙溶解区。3在培养基中加入底物检测细胞外酶、酶抑制剂等特定的底物可以与细胞外酶形成显色反应；酶的反应对特定底物形成溶解或沉淀。（三）筛选方法4各种抗生素产生菌的初筛（1）有代表性的常用试验菌（一部分是病原菌）。细菌真菌原虫革兰氏阴性菌革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌枯草杆菌八叠球菌肺炎双球菌产气杆菌大肠杆菌痢疾杆菌普通变形杆菌黑曲霉产黄青霉烟曲霉菌白色念珠痢疾阿米巴球虫4各种抗生素产生菌的初筛（2）各种抗生素产生菌的初筛采用抑菌圈法，亦称平板扩散法。杯碟法方法培养菌液溶化的琼脂48℃混合倒平板放检样杯碟培养无菌操作有抑菌圈为阳性反应三复筛1微生物初筛鉴定2发酵培养基的选择3培养与发酵4抽提试验三复筛1微生物初筛鉴定对初筛菌株进行分类——何属？何种？目的：预知微生物对人、动物或植物是否有致病性。但分类复杂。轻易不作。三复筛2发酵培养条件及培养基的选择（1）寻找产生目的代谢产物时的培养条件适合微生物生长的条件，不一定是目的代谢产物的高产条件。温度、PH、渗透压等进行一系列试验后，找出最适合的条件。（2）确定菌株生长发育、产生代谢产物时培养基的组分。菌种不同，发酵培养基不同。2发酵培养条件及培养基的选择放线菌：碳源以葡萄糖、淀粉为主氮源采用黄豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨、酵母膏无机盐氯化物、硫酸镁、碳酸钙。细菌：碳源以葡萄糖、柠檬酸钠为主氮源肉汤、蛋白胨、豆饼粉、酵母膏无机盐氯化钠、磷酸二氢钾，铁、锰、镁霉菌：碳源葡萄糖、蔗糖、乳糖氮源玉米浆、蛋白胨无机盐磷酸二氢钾、磷酸氢钾、镁、铁液体培养基常用组分表放线菌细菌霉菌植物病原菌碳源：葡萄糖、淀粉、糊精、蔗糖、麦芽糖葡萄糖、柠檬酸钠乳糖、葡萄糖、蔗糖葡萄糖、蔗糖氮源：大豆粉、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、硝酸铵肉汤、蛋白胨、豆饼粉、酵母膏、硫酸铵玉米浆、蛋白胨蛋白胨无机盐：氯化钠、碳酸钙、磷酸氢二钾氯化钠、磷酸氢二钾、锰、铁磷酸氢二钾、锰、铁磷酸二氢钾癌、磷酸氢钾、锰、铁三复筛3培养与发酵（1）试管培养试管摇床培养。常用。目的：原种斜面培养后，为了提高初筛效率。（2）摇瓶培养（摇瓶发酵）250或500ml锥形瓶再200rpm摇床上培养。目的：培养基和培养条件的初筛。3培养与发酵（3）玻璃自控发酵罐容量5～50L。是摇床向发酵罐的过渡阶段。目的：工艺参数、工艺条件的选择和考察。（4）试验罐培养中间工业试验阶段目的：放大和验证摇床试验结果，积累发酵工艺规律和发酵参数。为工业规模生产打基础3培养与发酵（5）发酵试验的三个阶段三复筛4抽提试验采取适当方法把发酵的目的代谢产物抽提出来。有四种方法：（1）溶媒抽提（2）用活性炭抽提（3）用树脂吸附洗脱（4）从菌丝体浸出抽提（1）溶媒抽提方法：选三个不同的且与水不能混合的溶媒，如苯、醋酸乙酯、丁醇。把培养滤液的PH调整到2或8，加入等量的上述溶媒，振荡抽提。蒸去溶媒，用少量甲醇溶解，以缓冲液稀释后检定。（2）用活性炭吸附方法：把发酵滤液PH调到2，加入1％的活性炭，搅拌30分钟后过滤，滤液PH调到8，加入80％的丙酮水溶液，搅拌抽提30min，分离丙酮提取液，蒸去丙酮，检定残余液体。（3）用树脂吸附洗脱方法：用强酸性或弱酸性阳离子交换树脂或用强碱性或弱碱性阴离子交换树脂进行吸附（4）从菌丝体浸出抽提方法：将分离的菌丝体用甲醇抽提后，过滤、蒸发得到的甲醇溶液为检定用试液。或将分离的菌丝体用水抽提后过滤的水浸液用于检定新抗生素的抽提试验发酵液过滤、分离（离心）4菌丝体浸出抽提水抽提甲醇抽提过滤过滤、蒸发抗菌活性试验甲醇浓缩液清液（滤液）1在不同PH条件下向溶媒转移2活性炭吸附洗脱溶出洗脱3树脂吸附洗脱酸碱溶媒洗脱抗性活性试验四抗菌谱的测定是筛选程序中的一环。检测抗生素对各种微生物的最小抑菌能力。方法：用加入1％甘油的普通琼脂培养基倒平板（A皿、B皿），A皿不添加抗生素做对照，B皿加入抗生素。将试验菌分区涂于琼脂培养基平板上并做记号（A、B按同样的序号涂板）。培养一定时间，观察菌体生长情况。例如：检测阿沙霉素。试验菌用米曲霉、新型隐球菌、点青霉、白色念珠菌、指间发癣菌、酿酒酵母六种菌株。