第六章兽药残留检测技术磺胺类1

第六章兽药残留检测技术第五节磺胺类药物残留的危害分析与检测方法一、概述磺胺类(Sµlfonamides)药物是兽医上较常用的一类合成抗感染药物,具有抗病原体范围广、化学性质稳定、使用方便、易于生产等优点。磺胺药种类繁多,兽医上常用的有10余种(图)。磺胺药单独使用,病原体易产生耐药性,与抗菌增效剂如TMP(甲氧苄啶)等联用,抗菌范围扩大,疗效明显增强,用来治疗畜禽肠道感染、乳腺炎、肺炎等疾病。同时也被广泛的用作饲料添加剂,用来增肥犊牛和猪。吸收后存在形式磺胺药吸收后,一部分在血浆中保持游离状态(游离型),一部分与血浆蛋白相结合(结合型),另一部分在肝脏中高度乙酰化变成乙酰磺胺。游离型具抗菌作用,且能透过毛细血管进入各种体液和组织。结合型无抗菌活性,也不能透入体液或组织中,但结合较疏松,能不断分解出游离型磺胺。乙酰化是磺胺的主要代谢产物,无抗菌活性。体内分布、代谢磺胺药在体内分布相当广泛。各种组织和体液均能到达。以血液中含量最高,肝、肾次之,胸水、腹水、滑膜液、房水中浓度也较高,并能透过胎盘进入胎儿体内。磺胺药在神经、肌肉及脂肪组织中的含量则较低。磺胺药主要在肝脏代谢,代谢方式有乙酰化、羟基化、结合等,其中以乙酰化为主。磺胺药乙酰化后失去抗菌作用,且在尿中的溶解度降低,易在肾小管析出结晶,造成对泌尿道的损害。应注意同服碳酸氢钠,并增加饮水,可减少或避免其对泌尿道的损害。部分磺胺药及代谢产物在肝内成为水溶性的葡萄糖醛酸结合物而失去活性。排泄内服难吸收的磺胺药,主要由粪便排出;内服易吸收的磺胺药主要通过肾脏排泄,通过肾小球滤过或肾小管分泌到达肾小管腔内的药物,有一部分被肾小管重吸收。重吸收少、排泄快的药物如磺胺异恶唑在尿中浓度较高,适用于治疗泌尿道感染。主要由肾小管分泌,重吸收多的药物在尿中浓度低,但在血中有效浓度维持时间较长,多属长效如SMZ、SMM等。磺胺药尚可经肠液、胆汁分泌排出,也可由乳汁排泄,但量较少。常见磺胺药磺胺嘧啶三甲氧苄啶磺胺二甲嘧啶磺胺二甲氧嘧啶磺胺喹恶啉磺胺噻唑巴喹普林二、样品处理常用的磺胺类药物,除少数外,一般具有以下的基本结构:磺酰胺基其化学性质可从四部分结构上表现出来,即:磺酰胺基(—SO2NHR)、芳伯氨基(—NH2)、芳环、N1及N4上的取代基。(R′=H),两性化合物,可溶于酸或碱溶液。磺酰氨基的酸性表现在N1上的活泼氢原子,其酸性的大小取决于N1上的取代基R。R的吸电性越大,则其酸性越强。化学性质本类药物水溶性较低,易溶于极性有机溶剂如乙醇、丙酮、乙腈、氯仿和二氯甲烷,难溶于非极性有机溶剂。由于磺胺药具有酸碱两性,通过调节溶液的pH值(pH7~9),可以使磺胺药呈不同状态,即中性分子还是离子分子,从而改变水相和有机相的分配系数。例如,磺胺的中性分子,在二氯甲烷等有机溶剂中分配系数大;离子态分子,则水性溶液中分配系数大。生物样品通过多次液-液萃取,可达到净化的目的。1、提取液体样品(如牛奶)可用水稀释过滤后,荧光直接检测,亦可用水性缓冲液或氯化钠溶液稀释,再进行净化处理。蜂蜜样品可用水或水性缓冲液稀释。组织样品(如肌肉、肾脏、肝脏)的预处理相对复杂些,一般采取均质、液-液萃取或固相萃取净化等步骤。液-液萃取操作烦琐,而蛋白沉淀后直接进样,虽操作简便、并具有较高的回收率,但对色谱柱的损害较为严重。溶剂提取溶剂提取时,应尽可能使组织中结合态的残留物溶解,并且除去大部分的蛋白质。一般可采用酸性水溶液、乙腈、氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮或混合溶剂等极性溶剂进行提取。二氯甲烷中加入离子对试剂四丁基铵(pH10),对鱼肉和动物组织的提取,发现磺胺二甲氧嘧啶和奥美普林的提取率很高。另外,提取过程中加入无水硫酸钠可脱去组织样品中的水分,有助于样品的充分提取。2、净化初提取液中含大量的内源性干扰杂质,在痕量分析时会干扰组分的测定,因此还需要净化处理。净化方法有液-液萃取、固相萃取、基质固相分散、在线痕量富集、液相色谱、在线透析和超临界流体萃取等。有时为了获得高的净化效果,几种方法相结合应用。液-液萃取液-液萃取尽管操作烦琐、耗费溶剂,但在所有净化方法中应用最广。通过调节样液的pH值,使磺胺类药物有选择性地在有机相与水相之间进行分配。例如,有机相提取液中的磺胺类药物可以被强酸溶液或碱性溶液抽提,若将水相提取液调节pH至5.1~5.6,可用二氯甲烷或乙酸乙酯进行再抽提。离子对提取法亦有应用,例如,水相提取液调节pH至10~11,加入四丁基铵离子对试剂,形成磺胺类离子对,可以被二氯甲烷提取。用正己烷或乙醚进行液-液萃取,可以脱脂肪。固相萃取由于甲氧苄啶常和其他磺胺药物同时使用,而它们具有不同的pKa和溶剂亲和力,难以在给定的pH值和溶剂系统中同时提取,宜采用固相萃取法(SPE)。常用的SPE柱,如C18和C8、硅胶柱、离子交换柱、Florisil柱和碱性氧化铝柱等。该法操作较为简便、并对生物样品具有较高的“净化”能力,可提高方法的提取回收率和精密度。亦可将几种小柱串联应用,可获得更高的净化效果。基质固相分散法目前只使用C18吸附剂,该方法简便、提取率和净化能力均高,已应用于鱼肉、牛肉、猪肉和牛奶样品的预处理。柱切换技术在线痕量富集技术可分离/净化牛奶样品中9种磺胺类药物：磺胺类药物在预富集柱RP-C18(10µm)中被保留浓缩,干扰杂质用淋洗剂洗去后,预柱中的磺胺类药物再用洗脱液洗脱,进入分析柱中分离。有研究者将TSK凝胶渗透柱和PLRP-S预富集柱串联使用,用于净化猪组织中的磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑和甲氧苄啶。在线透析采取在线透析、富集的方法,可测定动物源食品(肌肉、牛奶和蛋)中的13种磺胺类药物：利用纤维素膜选择性渗过分析物,到达预富集柱(C18、XAD-2或XAD-4),干扰杂质用淋洗剂洗去,浓缩后的分析物被洗脱后,进入分析柱分离。超临界流体萃取超临界流体萃取法被用于猪肾脏样品中甲氧苄啶和3种类固醇激素的提取分离。CO2提取时,分析物被保留在柱的进样端,大部分内源性干扰物被洗去后,分析物和一些极性干扰物用加入改性剂的CO2洗脱。三、分析方法生物样品中磺胺类药物的分析,光谱法(分光光度法、荧光光谱法)和色谱法（薄层色谱、气相色谱、液相色谱、超临界流体色谱）具有灵敏、快速、方便等优点。例如：分光光度法测定牛组织中的磺胺甲嘧啶，蜂蜜中的磺胺噻唑，奶中的乙酰磺胺、N-乙酰磺胺二甲嘧啶；薄层色谱法测定动物组织、猪肝、奶中的磺胺甲嘧啶，蜂蜜中的磺胺噻唑。1、光谱法光谱法主要用于样品中个别磺胺类药物的分析,最常用的方法为重氮化-偶合反应分光光度法。无N4取代基的磺胺类药物,或N4为酰氨基的磺胺类药物,经水解,在酸性介质中经重氮化后,可在碱性中与酚类(如β-萘酚、麝香草酚)偶合,在中性中与变色酸偶合,或在弱酸性中与胺类偶合呈色,于空白校正下,在一定波长处测其吸收度。与标准品对照,即可测定其含量。最常应用的是酸性偶合试剂,如N-(1-萘基)乙二胺(BrattonMarshall方法),测定波长随组分的不同略有不同,一般为540~545nm,已应用于牛组织和奶中的磺胺二甲嘧啶检测、蜂蜜中的磺胺噻唑检测。也有应用1-(β-二乙氨基-乙基-氨基)萘,优点为偶合形成的偶氮染料是水溶性的,且其吸收系数也较大。这两种偶合试剂遇亚硝酸都能变色,所以,经重氮化后,应以氨基磺酸盐将剩余的亚硝酸分解除去。光谱法选择性差,但可作为一种筛选法应用,如牛奶中磺胺醋酰和磺胺脒啶的筛选测定。2、薄层色谱法薄层色谱(TLC)经常作为样品筛选方法。经薄层色谱分离后的磺胺类药物,可按两种方法进行定量分析：洗脱定量法和薄层扫描定量法。洗脱定量法：从板上洗脱后,可按分光光度法,或与荧光胺、对二甲氨基苯甲醛反应后的比色法,或重氮化-偶合后的比色法进行。其中,以重氮化-偶合法最好。但与实际相比,测得值尚低5%~15%。结果偏低的主要原因是薄层色谱条件不稳定,吸附剂可能部分损失。板上洗脱后重氮化-偶合法如下:刮下的薄层用1mol/LHCl10mL提取,所得提取液先加0.1%NaNO2液1mL,5min后,再加0.5%氨基磺酸铵液1mL,强烈振摇后,加入0.1%N,N-乙基-N′(1-萘基)乙二胺草酸盐溶液1mL,10min后,用3cm的吸收池,以同法所得的试剂空白为对照,于546mm处(SMP、SIZ、ST的λmax)或542nm处[为SM2′、SPZ(磺胺苯吡唑）的λmax]进行测定。薄层扫描定量法薄层扫描法（TLCS）系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分值用于药品的质量检查的方法。随着制板、点样、展开等操作的仪器化及仪器性能的改进，薄层扫描法检测的灵敏度，结果的精密度与准确度均大大提高。与高效液相色谱法相比，具有多通道效应，可同时平行分离分析多个样品；流动相用量少且选择范围宽、更换方便；固定相为一次性使用，对样品的预处理要求不高等优点。应用TLC紫外分光光度法进行磺胺类药物定量分析时,有7%~11%的损失。如用无黏合剂的硅胶,以0.1mol/LNaOH调糊制板,可以获得较好的回收率。TLC的优点是设备简单、可以同时在多块板上点样,处理大量样品时间短,适合饲料、组织、体液样品的筛选分析。3、气相色谱法气相色谱法(GC)具有高的灵敏度和选择性,但由于磺胺类药物难挥发,测定时需要衍生化。一般用重氮甲烷甲基化,或甲基化后再用N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)进行硅烷化或N-甲基双(三氟乙酰胺)(MBTFA)乙酰化,以增加挥发性,改善色谱特性(热稳定性、降低极性),氢火焰离子化检测器测定。除了甲基化外,也可利用水解法将磺胺类药物水解成相应的挥发性胺类,继之以GC法测定,也可与适宜的卤化试剂反应,生成相应的衍生物,如三氟乙酰化或七氟丁酰化衍生物等,以电子捕获检测器测定。GC分离柱磺胺类药物的分离柱可用填充柱和石英毛细管柱,通常毛细管柱(DB-5)分离效果更好。样品确证分析时,一般用质谱检测器测定,离子源采用化学电离和电子轰击接口。多数磺胺类药物含有对氨基苯磺酰基结构部分,它们的结构差异只是N1取代基的不同,所以本类药物的质谱有许多共有的特征峰,如m/z56、l40、108、92、65和39等碎片离子峰。4、超临界色谱法Ramsey等用超临界流体色谱法测定猪肾组织中的甲氧苄啶和三种类固醇激素,分析柱为Spherisorb5氨基键合柱,含甲醇的CO2作流动相,热喷雾电离串联质谱检测器测定,检测限约10mg/kg,对于组织和奶中µg/kg级残留量的检测,灵敏度不够。5、高效液相色谱法20世纪80年代以来,普遍采用反相色谱法,使用C18、C8和苯基柱,尤以C18应用最广,以甲醇(或乙腈)-水(含醋酸或偏磷酸)系统为流动相,可分离检测数种磺胺类药物及其代谢物,样品可用甲醇或碱性缓冲液溶解制备。流动相中加入适量戊磺酸、己磺酸和辛磺酸离子对试剂,可以改变磺胺类药物的保留时间和改善峰形。HPLC的洗脱方式,一般采用等度洗脱,若需同时检测数种磺胺类药物或多种代谢物,可采用梯度洗脱,通过改变流动相流速或配比,实现在较短的时间内对生物样品中混合组分或代谢物的分离。由于甲氧苄啶分子结构中不含磺酰胺结构,其碱性较其他磺胺类药物强,在HPLC分离检测时,在ODS柱上会产生一定的拖尾现象,可采用反相离子对色谱法,以十二烷基磺酸或四丁基铵盐作为反离子,也可使用扫尾剂三乙胺改善其拖尾现象。但离子对色谱法对色谱柱有一定的损害作用,应予注意。有些用通常的HPLC法难以分离的磺胺类药物,使用β-环糊精化学键合固定相很容易达到分离。其分离原理,是基于当磺胺药物分子接近或透入到β-环糊精疏水腔内时可形成包合物,改变了磺胺类药物分子的某些理化性质。包合物的稳定性与磺胺类药物分子和β-环糊精分子的大小有关,与β-环糊精作用强的磺胺类药