第六章兽药残留检测技术苯并咪唑类1

第六章兽药残留检测技术第七节苯并咪唑类药物残留的危害分析与检测方法一、概述苯并咪唑类(Benzimidazoles，BEN)是一种驱虫剂,被广泛应用于动物寄生虫的治疗,同时还作为杀霉菌剂应用于庄稼存贮和运输期间,使其免受霉菌污染。自20世纪60年代早期,美国合成噻苯达唑以来,已合成数百种苯并咪唑类驱虫药。噻苯达唑作为第一个商品化的苯并咪唑类药物,曾广泛用于世界各地,用以驱除各种动物(如牛、绵羊、山羊、猪、马、禽等)胃肠道寄生虫。用于治疗时可一次内服给药,也可以低浓度置于饲料中长期使用做预防用。由于噻苯达唑驱虫作用不强,用药剂量较大,且驱虫谱不广,目前,已逐渐为其他苯并咪唑类药物——阿苯达唑、奥芬达唑、芬苯达唑、甲苯达唑、氟苯达唑等所取代。本类药物的特点是驱虫谱广,驱虫效果好,毒性低,甚至还有一定的杀灭幼虫和虫卵作用。苯并咪唑类中的帕苯达唑、坎苯达唑、阿苯达唑和奥芬达唑对妊娠早期(约妊娠三周)绵羊的胎儿有致畸作用,因此用于孕畜时应特别慎重。苯并咪唑类药物的结构式苯并咪唑类药物是一个庞大的化学家族,包括噻苯达唑的同系物、苯并咪唑氨基甲酸酯类,以及苯并咪唑环上的各种侧链取代物。苯并咪唑氨基甲酸酯类苯并咪唑环噻苯达唑的同系物苯并咪唑类药物1、噻苯达唑(Thiabendazole,TBZ)2、坎苯达唑(Cambendazole,CAM)3、苯硫脲酯(Thiophanate)4、非班太尔(Febantel,FEB)5、芬苯达唑(Fenbendazole,FBZ)6、奥芬达唑(OxfendazoIe,OFZ)7、阿苯达唑(Albendazole,ABZ)8、甲苯达唑(Mebendazole,MBZ)9、奥苯达唑(Oxibendazole,OXI)10、氟苯达唑(Flubendazole,FLU)11、三氯苯达唑(Triclabendazole,TCB)二、组织中苯并咪唑残留和限量苯并咪唑类药物在动物体内的残留物与药物本身有关外,还与给药途径、靶组织和消除期有关。标志残留定义为母体药物及其主要代谢产物的总和。部分苯并咪唑类药物的标志残留和最高残留限量(MRL)三、样品处理苯并咪唑类分子含咪唑环结构,两个氮原子具有酸碱两性,在适当的pH条件下,分子可以质子化(pKa约5~6)或去质子化(pKa约12)。在酸性或碱性条件下,大部分苯并咪唑类药物可解离,易溶于水性溶剂,并被提取,然后调节pH值使呈中性,用乙酸乙酯抽提。由于5-OH-TBZ在pH值范围内都能电离,易溶于酸性或碱性的水溶液,乙酸乙酯很难将其抽提出来。对于CAM、TCB和TCB代谢产物,它们都有两个或更多的pKa,因此溶剂提取时,控制溶液的pH值尤为重要。三氯苯达唑(TCB)、三氯苯达唑硫化物(TCB-SO)、TCB-SO2和CAM分别在pH7.3~10.9、5.0~9.0、3.8~8.0和7.4~11.1呈中性,因此,只有当pH7.4~8.0时,所有这些分子都呈中性。大部分苯并咪唑类药物在pH8时都呈中性,当预测某些苯并咪唑类药物的pKa约为8时,这时欲对这些组分同时提取变得相当困难。但也有例外,如MBZ-NO2和OXI在pH8.6和8.3,以非电离形式存在。1、水解肝和奶样中苯并咪唑类药物与蛋白结合率较高,不易被有机溶剂提取,可先将样品水解后再提取游离的药物。常用的水解方法有酸水解和酶水解两种。酸水解通常使用无机酸,例如用4moL/L盐酸于80~110℃,在1~4h即可完成水解。酸水解具有简便、快速、水解完全等优点,因而被广泛采用。酶水解酶水解通常使用β-葡糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶,前者可专一地水解葡萄糖醛酸苷结合物,后者可水解硫酸酯结合物。由于肝样中通常存在上述两种结合物,常使用β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯混合酶,控制pH4.5~7.0,于一定温度下孵育18~72h。与酸水解相比,酶水解比较温和,一般不会引起药物的分解,但有时水解不完全和实验费用高是该法的缺点。Tocco等发现TBZ在尿和奶中的代谢产物主要是5-OH-TBZ与葡糖苷酸和硫酸酯结合物,结合物用β-葡糖苷酸酶/硫酸酯酶或酸(6mol/L盐酸回馏1h)水解,释放出游离的5-OH-TBZ。Chuckwudebe等对TBZ在蛋鸡和奶牛中代谢产物进行了研究,发现结合物主要是硫酸酯结合物。Markus等对肝样中的ABZ及其相关代谢物的结合物用酸解方法进行水解,释放出游离的ABZ-NH2-SO2。Coulet等对组织中的TBZ蛋白结合物用碱解方法水解。2、提取及净化液-液萃取(LLP)是提取苯并咪唑类药物的最常用方法,通常将水性溶液调节至适当的pH值,用水不相溶的有机溶剂提取。用酸溶液提取时,即包括了样品的水解过程。由于苯并咪唑类药物的极性和pKa差异很大,因此多残留提取相当困难,即使对单一药物,母药及其代谢产物的同时提取亦难。例如MBZ及其两个代谢产物MBZ-OH和MBZ-NH2,由于MBZ和MBZ-NH2呈碱性,pKa分别是3.5和5.5,在pH7.5时,这两种化合物不被电离;MBZ-OH含酸性的-OH,其pKa为9.8,在pH7.8时不被电离。因此,溶液只有在pH7.5~7.8间,所有化合物不被电离,呈中性,这时可用极性溶剂(如:乙腈、甲醇、水-乙腈、水-甲醇等)来提取。(1)血浆、血清或其他生物液体生物体液样品中的苯并咪唑类可用有机溶剂提取,直接进样分析。Bogan等将血浆样品调节至pH7.4,用乙酸乙酯来提取FBZ、OFZ和ABZ。Hoaksey等将血浆样品用乙腈脱蛋白,再用二氯甲烷提取ABZ和ABZ-SO。Alvinerie用乙酸乙酯提取血浆中TCB、TCB-SO和TCB-SO2,以及TBZ和5-OH-TBZ,直接用HPLC-UV测定。Allan等将血浆样品用酸性溶液稀释后过C18小柱,依次用20mL水、0.5mL甲醇+水(40+50)和0.4mL甲醇淋洗,最后用1.6mL甲醇洗脱,甲苯达唑及其代谢物的回收率大于80%。Hennessy等将这一方法用于胆汁中TCB的提取,但样品过柱前先用乙酸乙酯提取,后来也用于血浆样品中ABZ的提取。自动萃取仪具有省时、省力、重复性高的优点,应用日趋广泛。Rouan等采用自动萃取仪、C18固相萃取柱提取/净化血浆样品中TCB,回收率可达到90%以上。(2)组织动物组织中的苯并咪唑类提取一般用有机溶剂,并经LLP和SPE净化。有人采用LLP和SPE相结合方法进行净化,用HPLC-UV检测。也有人采用LLP的单一净化方法,用选择性高的荧光检测或LC-MS/MS检测。虽然LLP净化方法选择性较差,但适合于苯并咪唑类的多组分提取,而用复杂的净化方法可能回收率较低。Brandon等用二甲亚砜-水(10+90)来提取肝组织中的TBZ,在ELISA测定前用PBS稀释。Brandon等采用类似的方法,用二甲亚砜-水(10+90)提取肝组织中11种苯并咪唑类残留,包括水溶性低的FBZ。Marti等用乙腈提取肌肉、肝脏、肾脏组织中8种苯并咪唑类残留,提取物用LLP净化,包括正己烷、饱和氯化钠和二氯甲烷洗涤,然后用C18固相萃取柱浓缩/净化,再用HPLC-UV或GC-MS分析,除OFZ外,回收率均在65%以上,OFZ在肝脏和肾脏中的回收率仅为45%和39%。Farrington等用乙酸乙酯提取肝组织中5种苯并咪唑类残留,并用酸性氧化铝和C18柱净化,HPLC-UV分离测定,回收率在73%~90%。Blanchflower等用甲醇-水(20+7)提取肝和肌肉组织中FBZ和OFZ,提取液用石油醚洗涤,经磷酸盐缓冲液稀释后,再用乙醚-乙酸乙酯(60+40)洗涤,FBZ和OFZ的回收率大于80%和70%。Wilson等用乙酸乙酯提取肌肉和肝组织中8种苯并咪唑类残留。Wilson方法被广泛应用于动物组织中苯并咪唑类残留的提取/净化。Hajee等对鳗鱼肉的均质液用磷酸盐缓冲液调节至pH7.5,发现只有在pH7.5~7.8之间,所有的MBZ标志残留物(MBZ、MBZ-OH、MBZ-NH2)呈中性,能被乙酸乙酯提取;在SPE净化中分别采用正相和反相柱,发现氨基丙基柱较合适;在过氨基丙基柱前,先用正己烷调节乙酸乙酯提取液的极性,上样后,氨基丙基柱用异辛烷淋洗,再用甲醇洗脱;MBZ、MBZ-NH2和MBZ-OH的平均回收率分别为80%、60%和85%。Cannavan等用乙酸乙酯提取肝、肾和肌肉组织均质液(调节至pH7.0)中TBZ和5-OH-TBZ,过氰丙基(CN)SPE柱,TBZ和5-OH-TBZ的回收率分别为96%~103%和70%~85%,若采用氘化TBZ作为内标物,可提高5-OH-TBZ回收率的重现性。Capece等在pH8.0条件下用乙酸乙酯提取肌肉、脂肪和肾脏组织中的FBZ标志残留物,提取液直接HPLC分析。DeRuycke等在碱性条件下用乙酸乙酯提取鸡蛋和肌肉组织中FLU、FLU-HMET和FLU-HMET,提取液蒸干,再用甲醇和正己烷进行液-液分配净化,LC-MS/MS分析,FLU标志残留物的回收率在70%(鸡蛋)~87%(肌肉)之间。Edder等在碱性条件下从肝脏和肌肉中提取了11种苯并咪唑类药物和左旋咪唑残留,用MBC作为内标,提取物经甲醇和正己烷液-液分配净化,回收率大于70%。等等(3)牛奶和奶制品奶制品相对于组织样品要容易处理些,而且牛奶含更少的色素和内源性干扰物。牛奶样品一般要脱蛋白和脂肪预处理,再调节溶液pH值,用水不相溶的有机溶剂(如:乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷)来提取,pH值的选择与被测物的种类和数量有关。例如Tocco等发现在pH6时,用乙酸乙酯可提取牛奶中TBZ和5-OH-TBZ。Fletouris等发现在pH9.8时,用乙酸乙酯提取牛奶中ABZ、ABZ-SO和ABZ-SO2的效果最好,回收率分别为81%、78%和100%。后来他们在pH10时,用乙酸乙酯提取牛奶中10种苯并咪唑类残留,比较了不同的pH值(3~11.5)对提取效率的影响,发现pH10时大多数苯并咪唑类药物的回收率较高,平均回收率为79%~100%,FBZ的回收率为56%~66%。Flotouris等还试验了在pH2~9条件下用乙腈提取,FBZ的回收率接近100%,表明用乙腈提取时,pH值的变化对提取效率影响不大。牛奶中多残留分析的提取和净化方法三、分析方法苯并咪唑类药物残留的测定方法主要有生物检测法、分光光度法、薄层色谱法、免疫分析法、气相色谱法和液相色谱法，采用紫外、荧光和质谱检测。1、生物检测法生物检测法曾被用来检测食品中苯并咪唑类残留,但现在大部分用来评价驱虫剂的效能。生物检测法首先用TLC板将残留物分离出来,然后用含培养剂和生物指示剂的溶液喷雾TLC板,TLC板上抑制生物繁殖的区域表明药物残留的存在,抑制区域的大小与残留物的浓度有关。Erwin等建立了一种检测BEN的生物学方法；Peterson等建立了农作物中BEN和MBC的生物检测法,提取液通过硅胶TLC板分离BEN和MBC残留物,随后用琼脂和青霉素芽孢混合液喷雾,室温培养20h,生物检测法的灵敏度比紫外分光光度法高出十倍左右。Dew等利用猪蛔虫幼体对TBZ、ABZ、ABZ-SO、ABZ-SO2和MBZ敏感性,建立了一种生物筛选法;生物检测法作为检测食品中苯并咪唑类残留的筛选方法,具有成本低的优点,但生物体对苯并咪唑类药物的敏感性差异很大,实际应用中还需作进一步的评估。2、分光光度法采用分光光度法测定农作物中的BEN残留。Pease等先将BEN转化为2-氨基苯并达唑(2-AB),然后用溴衍生化,再进行荧光光度法(λex285nm,λem335nm)或紫外-可见分光光度法(445nm)测定,检测限为100µg/kg。2-AB、TBZ和2-(2-呋喃)-苯并咪唑本身具有荧光,然而只有2-AB与溴反应可产生有色衍生物。因此,溴化后通过紫外-可见分光光度法测定,可区别2-AB和其他苯并咪唑