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基因工程专题一第二节基因工程的基本操作程序专题一目标定位1预习导学2要点精析3思维升华4知识构建5课时作业7应用探究6目标定位1．了解目的基因获取的常见方法。2．理解基因表达载体的构建是基因工程的核心。(重、难点)3．掌握将目的基因导入受体细胞的方法。(重点)4．理解目的基因的检测与鉴定。预习导学基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：①____________________、②_____________________、③_______________________、④_________________________。一、目的基因的获取1．从基因文库中获取目的基因：将含有某种生物⑤________的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的⑥________，称为基因文库。基因文库可大可小，如果它包含了一种生物所有的基因，就叫⑦___________；如果它只包含一种生物的一部分基因，就叫⑧______________，如⑨__________。目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定不同基因不同基因基因组文库部分基因文库cDNA文库2．从基因文库中获取目的基因的具体方法：可根据基因的⑩________序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA以及基因翻译产物⑪________等特性来获取目的基因。3．利用PCR技术扩增目的基因：PCR技术是一项在生物体外⑫________特定DNA片段的核酸合成技术。(1)原理：利用⑬______________原理，将基因的核苷酸序列不断加以复制，使其呈指数方式增加。指数扩增约为2n(n为扩增循环的次数)。核苷酸蛋白质复制DNA双链复制(2)条件：已知目的基因的一段⑭________序列、⑮________、⑯________、⑰___________。(3)过程：目的基因DNA受热变性后解链为⑱________，与引物结合，然后在⑲____________的作用下进行延伸形成DNA。4．人工合成法：⑳________比较小，核苷酸序列已知，可以人工合成。核苷酸引物模板DNADNA聚合酶单链DNA聚合酶基因二、基因表达载体的构建(基因工程的核心)1．目的：○21__________________________________________________________________________________________。2．组成：目的基因(符合人们需要的，编码蛋白质的○22________)、○23________(是一段有特殊结构的○24________，位于基因的首端，是○25___________识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的○26________)、终止子、标记基因(作用：○27______________________________________________________________________________________；常用的标记基因是○28________________等)。是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用结构基因启动子DNA片段RNA聚合酶蛋白质为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来抗生素抗性基因三、将目的基因导入受体细胞1．将目的基因导入植物细胞一般采用的方法是○29____________。其中，转化是指目的基因进入○30________________―→农杆菌→导入植物细胞→稳定维持和○31________。另外两种方法还有○32________和○33_____________。2．将目的基因导入动物细胞一般采用的方法是○34________。农杆菌转化法Ti质粒的T－DNA表达基因枪法花粉管通道法显微注射技术3．将目的基因导入微生物细胞，是因为原核生物具有的特点是○35_________________________________________。最常用的转化方法是用○36________处理细胞→感受态细胞→○37____________与感受态细胞混合→感受态细胞吸收○38________。繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等钙离子重组表达载体DNA分子四、目的基因的检测与鉴定1．分子检测(1)首先检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了○39___________，可用○40__________________；(2)其次检测目的基因是否○41______________，可用○42______________________________；(3)最后检测目的基因是否○43____________________，可用○44____________________。2．个体生物学水平鉴定：如做抗虫或抗病接种实验。目的基因DNA分子杂交技术转录出mRNAmRNA与DNA杂交技术翻译成蛋白质抗原—抗体杂交法[思维激活]1．为什么要用同一种限制酶切割质粒和含目的基因的DNA分子？2．用于构建基因表达载体的质粒为什么必须具有启动子和终止子？3．植物基因工程常用的受体细胞为什么可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？[答案]1．目的是产生相同的黏性末端，便于两者完全拼接。2．导入到受体细胞的目的基因的表达需要调控序列，因此在插入目的基因的部位之前需有启动子，之后需有终止子。3．植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。要点精析一、目的基因的获取目的基因的获取概括地说主要有两条途径：①可以从自然界中已有的物种中分离出来②可以用人工的方法合成1．从基因文库中获取目的基因：基因文库的构建实际上就遵循基因工程的基本操作程序。做法是：将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制性核酸内切酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都包含了一段不同的DNA片段。也就是说，这个群体包含了这种生物的所有基因，构成了这种生物的基因组文库。如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。cDNA文库与基因文库的区别可具体参阅教材中的“生物技术资料卡”。2．利用PCR技术扩增目的基因：PCR技术是利用DNA双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。利用PCR技术获取目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。扩增的过程是：目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环多次。上述过程可以在PCR扩增仪中自动完成。3．人工合成目的基因：人工合成目的基因的方法主要有两种。(1)反转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其序列的基因，它是以目的基因的mRNA为模板，借助反转录酶合成碱基互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA。(2)化学合成法：即依照某一蛋白质的氨基酸序列，通过密码子推算出其基因序列，然后直接合成目的基因。知识贴士：由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，不能直接用于基因的扩增和表达，因此，在获取真核细胞中的目的基因时，一般是用人工合成目的基因的方法。目的基因的分离是基因工程研究中的主要方面和操作关键。下面甲、乙图表示从真核生物细胞中获取目的基因的两种方法，请回答下列问题。(1)在甲图中，a过程是在________酶的作用下完成的。如果用该类酶中的一种，不一定能获取目的基因，其原因是__________________________________________。(2)在乙图中，c过程在遗传学上称为________，d过程称为________，d过程需以mRNA为模板，________为原料，还需要的条件是ATP、________、DNA聚合酶等。(3)除了上述两种方法可以获取目的基因外，请你再写出一种方法：__________________________________________。[解析]获取目的基因的方法较多，甲是通过限制酶获取目的基因，但由于切割位点可能在基因内部，故可能得不到想要的目的基因；乙是通过信使RNA逆转录形成DNA(目的基因)的过程；此外，还可通过蛋白质中氨基酸的排列顺序推测基因的脱氧核苷酸序列，再进行化学合成。[答案](1)限制性核酸内切一种限制性核酸内切酶只能对特定的碱基序列进行切割，此序列若在目的基因内部，则不能得到目的基因(2)转录逆转录脱氧核苷酸逆转录酶(3)根据已知蛋白质中的氨基酸序列，可以推知基因的脱氧核苷酸序列，再进行化学合成下列获取目的基因的方法中需要模板链的是()①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④D．②③[答案]D[解析]PCR利用的是DNA双链复制原理。即将双链DNA之间的氢键打开，变成单链DNA，作为聚合反应的模板。反转录法则是以目的基因转录成的信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下，先反转录形成互补的单链DNA，再合成双链的DNA。①④则均不需要模板。二、基因表达载体的构建基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。1．构建目的：其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2．表达载体的组成：启动子＋目的基因＋终止子＋标记基因。(1)目的基因外源DNA分子的有效片段。(2)启动子一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶的识别和结合部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。(3)终止子位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA短片段。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录到此终止。(4)标记基因鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因就可以作为这种基因。3．目的基因与载体的结合：将目的基因与载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒为载体，将目的基因与质粒结合的步骤是：(1)用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有黏性末端的切口。(2)用同种限制酶切断目的基因，产生相同的黏性末端。(3)将切下的基因片段，插入到质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。4．差异性：由于受体细胞有动物、植物、微生物之分，加之目的基因导入受体细胞的方法不同，所以表达载体的构建也会有差异性。知识贴士：①生物之间进行基因交流，需使用启动子和终止子才能比较有利于基因的表达。如通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中，此目的基因无法进行转录。②目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记。③为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等。④有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标记存在部位的基因(或做成目的基因与标记基因的融合基因)，如绿色荧光蛋白基因等。下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切点。请回答下列问题：(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有________个游离的磷酸基团。(2)若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越________。(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是________。(4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止________