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抗虫棉的培育的过程：基因工程的基本操作程序（1）目的基因的获取（2）（3）将目的基因导入受体细胞（4）目的基因的检测与鉴定基因表达载体的构建一、目的基因的获取1.目的基因：2.获取方法：（1）从基因文库中获取目的基因；（2）利用PCR技术扩增目的基因；（3）通过DNA合成仪用化学方法直接合成主要指的是编码蛋白质的结构基因补：原核细胞的基因结构编码区下游非编码区非编码区编码区编码区上游启动子终止子补：真核细胞的基因结构内含子外显子编码区非编码区非编码区启动子终止子编码区上游编码区下游RNA聚合酶的始结合位点RNA聚合酶的末结合位点结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子内含子：外显子：（一）从基因文库中获取目的基因（序列未知）1.基因文库基因文库基因组文库部分基因文库（cDNA文库）基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因组文库的构建模式图部分基因文库的构建模式图基因组文库和部分基因文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以解旋酶催化1)解旋模板2)合成互补子链以母链为模板进行碱基配对(在DNA聚合酶的催化下,利用游离的脱氧核苷酸进行)母链（旧链）子链（新链）子代DNA:同时进行(边解旋边复制)组成3)形成新的DNA分子补：DNA复制过程：作用：把单个脱氧核苷酸连接成链(形成磷酸二酯键)2.利用PCR技术扩增目的基因1概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术。2原理：DNA复制原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶多聚酶链式反应体外特定DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列PCR技术的操作过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加___倍一PCR技术的操作过程PCR技术的操作过程PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术场所原理条件解旋方式酶特点结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等过程：变性、退火、延伸三步曲变性：90～95℃退火：55～60℃延伸：70～75℃3.人工合成法利用DNA合成仪人工合成的前提：基因较小，核苷酸序列已知蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化学合成推测推测思考：化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？课堂小结1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库归纳：获取目的基因的方法思考：为什么要构建基因表达载体？（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够表达和发挥作用。二、构建表达载体思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。2.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因启动子：终止子：标记基因：位于基因首端的一段特殊的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。位于基因尾端的一段特殊的DNA片段，能终止mRNA的转录。鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。相同点：不同点：思考：载体与表达载体的异同都有标记基因和复制原点。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶切割两个切口获得目的基因DNA连接酶连接重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端用同一种限制酶分别切割目的基因个质粒，使之露出相同的粘性末端，并用DNA连接酶使之连接三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法（1）农杆菌转化法①特点：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。②转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（2）基因枪法适用于单子叶植物（3）花粉通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。适用于被子植物2.将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）（2）操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到输卵管或子宫受精卵发育新性状动物常用法：常用菌：微生物作受体细胞原因：过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA3.将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理大肠杆菌繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少受体生物植物动物微生物受体细胞导入方法受精卵体细胞受精卵细胞/个体农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术用Ca2+处理成感受态细胞小结：将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？1真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。2目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？不一定，需要检测四、目的基因的检测与鉴定检测:是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定:分子水平鉴定个体生物学水平鉴定转基因生物的DNA探针15N15N14N14N（1）检测是否插入了目的基因基因探针：放射性同位素等标记的DNA分子方法——DNA分子杂交技术（DNA与DNA）变性变性1、检测——分子水平的检测变性方法——DNA与mRNA杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了mRNA探针15N15N转基因生物的mRNA14N14N1、检测——分子水平的检测1、检测——分子水平的检测提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质出现杂交带脱分化组织培养（二）鉴定（个体生物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等类型步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交（DNA和DNA之间）是否成功显示出杂交带第二步目的基因是否转录出mRNA分子杂交技术（DNA和mRNA之间）是否成功显示出杂交带第三步目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交是否成功显示出杂交带个体水平鉴定包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。目的基因的表达和检测归纳:基因工程的基本操作程序1.获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成2.构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞感受细胞法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）4.目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译；个体课堂练习1、有关基因工程的叙述中，错误的是()A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B、限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、人工合成目的基因不用限制性内切酶A课堂练习2、下列属于获取目的基因的方法的是()①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取③从受体细胞中提取④利用PCR技术⑤利用DNA转录⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥D课堂练习3、有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D课堂练习4、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A、人工合成目的基因B、目的基因与运载体结合C、将目的基因导入受体细胞D、目的基因的检测和表达C【拓展深化】只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对课堂练习即时应用(随学随练，轻松夺冠)5．(2009年高考浙江卷)下列关于基因工程的叙述，错误的是()A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达D