第十六章抗生素类药物的分析

药物分析（第七版）第十六章第十六章抗生素类药物的分析第一节概述第二节β-内酰胺类抗生素第三节氨基糖苷类抗生素第四节四环素类抗生素第五节抗生素类药物中高分子杂质的检查药物分析（第七版）第十六章定义：抗生素是生物（动物、植物和微生物）在其生命活动中产生的（或并用化学、生物或生化方法衍生的），在低微浓度下有选择性地抑制或影响它种生物机能的化学物质的总称。来源：生物合成（发酵）化学合成或半合成第一节概述药物分析（第七版）第十六章一、特点1.化学纯度低：同系物多、异构体多、降解产物多2.活性组分易变异：菌株变化、发酵条件改变3.稳定性差（本身分子结构不稳定，易分解，使疗效降低或失效甚至产生毒副作用）药物分析（第七版）第十六章二.分类β–内酰胺类(青霉素类、头孢菌素类)氨基糖苷类(链霉素、庆大霉素、依替米星)四环素类(四环素、金霉素、土霉素)大环内酯类(红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素)多烯大环类(制霉菌素、两性霉素B)多肽类(多黏菌素、放线菌素)酰胺醇类抗生素（氯霉素）抗肿瘤抗生素（有丝裂霉素、盐酸多柔比星）其它抗生素：盐酸克林霉素、盐酸林可霉素等。1.根据产生抗生素的生物来源分类2.根据抗生素的作用对象分类3.根据抗生素的作用机制分类4.根据抗生素的化学结构分类药物分析（第七版）第十六章（一）鉴别1.理化方法（1）官能团显色反应（2）光谱法（3）色谱法2.生物学法三、抗生素的质量分析药物分析（第七版）第十六章1.影响药物稳定性的项目酸碱度、水分等。2影响药物纯度的项目溶液澄清度与颜色、有关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属、吸光度等。3.与临床安全性密却相关的项目：异常毒性、热原或细菌内毒素、降压物质、无菌等。4.其它：如注射用普鲁卡因青霉素还规定了悬浮时间与抽针试验等。（二）检查药物分析（第七版）第十六章青霉素钠Ch.P.（2010）结晶性酸碱度溶液的澄清度与颜色吸光度有关物质青霉素聚合物干燥失重可见异物不溶性微粒细菌内毒素无菌药物分析（第七版）第十六章（三）含量测定方法1.抗生素微生物检定法药典附录测定抗生素抑菌或杀菌的能力优点与临床要求一致灵敏度高、用量少适用范围广，可用于未知药物缺点操作繁琐、测定时间长、测定误差大药物分析（第七版）第十六章2.理化方法以理化方法测定抗生素的效价适用于纯度较高的结构确定的抗生素优点1.准确度高2.简单、快速1.不一定代表生物效价2.易受杂质干扰缺点3.抗生素活性表示方法以效价表示，即指每毫升或每毫克中含有抗生素的有效成分的多少。药物分析（第七版）第十六章磺苄西林钠Ch.P.（2010）【含量测定】精密称取本品适量，用灭菌水制成每1ml中约含1000单位的溶液，照抗生素微生物检定法（附录ⅪA）测定。1000磺苄西林单位相当于1mg的C16H18N2O7S2。药物分析（第七版）第十六章第二节β-内酰胺类抗生素主要药物：青霉素类头孢菌素类药物分析（第七版）第十六章RCONSCH3CH3COOHOHN青霉素类RCONONHSCH2R1COOH头孢菌素类氢化噻唑环氢化噻嗪环-内酰胺环药物分析（第七版）第十六章青霉素类RCONSCH3CH3COOHOHN6-氨基青霉烷酸（6－APA）***手性C酸性不稳定1OCcm1740~1815V酰胺侧链药物分析（第七版）第十六章ONSNOHHHCH3CH3OHOH青霉素（苄青霉素）包括青霉素钾、青霉素钠、普鲁卡因青霉素。药物分析（第七版）第十六章ONSHHHCH3HNH2ONCH3OOHHH2O3氨苄西林（氨苄青霉素）.药物分析（第七版）第十六章H2O3NHONOSOCH3CH3HHHH2NHOOHH阿莫西林（羟氨苄青霉素）.药物分析（第七版）第十六章磺苄西林钠（磺苄青霉素钠）HONSNOHHHCH3CH3ONaOSOONaO药物分析（第七版）第十六章头孢菌素类RCONONHSCH2R1COOH7-氨基头孢菌烷酸（7－ACA）**手性C酸性酰胺侧链不稳定1OCcm1740~1815VUV药物分析（第七版）第十六章H2ONNOOHHH2NHSCH3OHOH头孢氨苄.H2ONNOOHHH2NHSCH3OHOHOH头孢羟氨苄头孢拉定HNNOOHHH2NHSCH3OHOHNNOOHHSONaOOCH3OS头孢噻吩钠药物分析（第七版）第十六章一、性质1.酸性游离羧基酸性，易与碱成盐。2.旋光性-手性碳3.紫外吸收特性青霉素母核无吸收，但通常其侧链有吸收；头孢菌素母核O=C-N-C=C，在260nm处强吸收。药物分析（第七版）第十六章21药物分析（第七版）第十六章4.稳定性-内酰胺环为四元环，张力大，且酰胺键易水解，不稳定。稳定性与含水量和纯度相关。在水溶液中，易受酸、碱、酶、金属离子或氧化剂的影响，发生水解和分子重排。药物分析（第七版）第十六章23降解、失效青霉素类酸、碱、青霉素酶温度↑氧化剂（头孢噻吩钠水溶液25℃24h失活8%）降解、失效头孢菌素类酸、碱、胺类内酰胺酶（青霉素钠水溶液30℃24h失活56%）Cu2+、Pb2+、Hg2+、Ag+药物分析（第七版）第十六章24不同pH条件下青霉素钠降解情况24℃0.41.4129233621812531.29.31.4半衰期(h)234567891011pH药物分析（第七版）第十六章青霉素的降解反应青霉素青霉噻唑酸H2O/OHˉ青霉素酶青霉酸pH2100℃α–青霉噻唑酰基羟胺酸NH2OH青霉烯酸pH4青霉胺CO2青霉醛HgCl2药物分析（第七版）第十六章二、鉴别本类药物的鉴别试验，国内外药典中主要采用的方法为IR、HPLC、TLC法。（一）色谱法1.TLC与对照品比较Rf值与斑点颜色2.HPLC与对照品比较tR值药物分析（第七版）第十六章（二）光谱法1.IR法特征官能团：117401815cm~VOC116901710cm~VOC酰胺β-内酰胺2.UV法药物分析（第七版）第十六章CH3NSOHNCH3COONaOCCH2青霉素钠药物分析（第七版）第十六章1.羟肟酸铁反应内酰胺羟肟酸衍生物头孢菌素类青霉素类盐酸羟胺OH-呈色Fe3+H+（三）呈色反应头孢哌酮Ch.P.（2010）【鉴别】（1）取本品约10mg，加水2ml与盐酸羟胺溶液3ml，振摇溶解后，放置5分钟，加酸性硫酸铁铵试液1ml，摇匀，显红棕色。药物分析（第七版）第十六章2.茚三酮反应蓝紫色氨基茚三酮△注射用头孢拉定Ch.P.（2010）TLC鉴别显色剂:茚三酮药物分析（第七版）第十六章3.三氯化铁反应酚羟基偶合呈色三氯化铁头孢羟氨苄Ch.P.（2010）【鉴别】（1）取本品适量，加水适量超声使溶解并稀释制成每1ml中约含12.5mg的溶液，取溶液1ml，加三氯化铁试液3滴，即显棕黄色。药物分析（第七版）第十六章4.各种盐的反应焰色→鲜黄色+醋酸氧铀锌→↓黄Na+焰色→紫色+0.1%四苯硼钠+Ac—→↓白K+K+、Na+反应药物分析（第七版）第十六章（一）聚合物1.定义高分子杂质指抗生素药品中分子量大于药物本身的杂质的总称。分子量一般在1000～5000道尔顿，个别可至10000道尔顿。分为内源性和外源性杂质。三、检查药物分析（第七版）第十六章34例青霉素钠【检查】青霉素聚合物青霉素钾【检查】青霉素聚合物阿莫西林【检查】阿莫西林聚合物（青霉噻唑蛋白+青霉素、青霉噻唑多肽类）头孢他啶【检查】头孢他啶聚合物头孢曲松钠【检查】头孢曲松聚合物头孢哌酮钠【检查】头孢哌酮聚合物药物分析（第七版）第十六章外源性杂质：包括蛋白、多肽、多糖类杂质或其与抗生素的结合物。主要来于自发酵工艺。内源性杂质：自身聚合物。生产或贮藏过程中产生。2.来源3.高分子杂质的分类（1）青霉噻唑蛋白和青霉噻唑多肽（2）青霉素聚合物（3）头孢菌素聚合物药物分析（第七版）第十六章364.分析方法反相色谱法离子交换色谱法凝胶色谱法（分子排阻色谱法）药物分析（第七版）第十六章聚合物检查方法：多用分子排阻色谱法。即根据分子量差异进行分离的凝胶色谱法。凝胶色谱具有分子筛的作用，让药物分子自由的进入凝胶颗粒表面，而高分子杂质被排阻，不能进入颗粒内部；色谱过程中凝胶对药物的吸附作用大于对高分子杂质的吸附作用，可使高分子杂质与药物分离。药物分析（第七版）第十六章38药物分析（第七版）第十六章39高分子杂质定量测定法：1.主成分自身对照法2.面积归一化法3.限量法4.自身对照外标法药物分析（第七版）第十六章β-内酰胺类抗生素的高分子杂质具有高度的不均一性和不确定性，故无法制备对照品，不能采用对照品法定量。在以水，0.01%SDS或0.5%葡萄糖溶液作为流动相时，β-内酰胺类抗生素可缔合形成表观分子量较大的缔合物，该缔合物在SephadexG10凝胶色谱系统中的色谱行为与高分子杂质一样，表现为单一的色谱峰。利用这一特点，在SephadexG10凝胶色谱系统中制定了新的定量方法-----自身对照外标法。药物分析（第七版）第十六章41例1青霉素钠Ch.P.（2010）【检查】青霉素聚合物照分子排阻色谱法（附录ⅤH）测定。填充剂葡聚糖凝胶G-10（40~120µm）流动相A0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）[0.1mol/LNa2HPO4-0.1mol/LNaH2PO4（61:39)]流动相B水流速1.5ml/min波长254nmn≥700（按蓝色葡聚糖2000计）杂质限量0.08%药物分析（第七版）第十六章头孢呋辛酯-HPLC异构体规定峰面积大小比值有关物质主成分自身对照法（二）异构体和有关物质药物分析（第七版）第十六章（三）2-乙基己酸-内酰胺环制备过程中，采用游离酸与2-乙基己酸钠作用生成钠盐，并在2-乙基己酸中直接析出钠盐结晶，易残留2-乙基己酸。检查方法：GC（杂质对照品法）药物分析（第七版）第十六章头孢哌酮钠Ch.P.（2010）【检查】吸光度取本品约1g精密称定，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，照紫外-可见分光光度法（附录ⅣA），在430nm的波长处测定吸光度，不得大于0.15。（四）吸光度（五）有机溶剂部分药物需检查有机溶剂。药物分析（第七版）第十六章（六）结晶性固态物质分为结晶质和非结晶质两大类，可用下列方法检查物质的结晶性。（1）偏光显微镜法；（2）X射线粉末衍射法。（七）水分影响稳定性的重要因素。（八）其他特殊杂质药物分析（第七版）第十六章头孢克洛含量测定Ch.P.（2010）【含量测定】填充剂十八烷基硅烷键合硅胶流动相磷酸二氢钾溶液–乙腈（92︰8）（pH3.4)对照品头孢克洛（含头孢克洛δ-3-异构体）两者分离度应大于1.5四、含量测定（一）高效液相色谱法药物分析（第七版）第十六章（二）碘量法原理：β－内酰胺类不直接与碘反应；β－内酰胺类水解产物可与碘发生定量反应。药物分析（第七版）第十六章反应分两步进行：应：严格控制反应条件采用标准品平行操作（2）氧化-还原反应（无固定量关系，易受温度、pH值和时间等因素影响）（1）水解反应（按化学计量进行）青霉素中本身含有降解杂质，或样品中含其它杂质，可能消耗碘，碘挥发也带来损失。以未经水解的样品做空白。药物分析（第七版）第十六章方法：供试液+缓冲液+碘液+回滴（空白）+碱+酸+缓冲液+碘液+回滴对照液+缓冲液+碘液+回滴（空白）+碱+酸+缓冲液+碘液+回滴要求做空白及应与标准对照平行测定药物分析（第七版）第十六章测定条件（1）必须碱性水解完全后才能测定（2）该法用不加碱水解的样品作空白，可消除降解产物及其他耗碘杂质的干扰（3）1mol样品消耗4molI2，灵敏度高（4）碘与青霉噻唑酸作用以pH4.5，温度在24～26℃为好（5）采用对照品平行测定药物分析（第七版）第十六章（三）汞量法青霉胺青霉噻唑酸青霉素类OHOH水解水解青霉胺络汞2Hg6.4pH药物分析（第七版）第十六章1.原理青霉素分子不与汞盐反应，但其碱水解产物青霉噻唑酸及继续水解产物青霉胺都可与汞盐定量反应，根据消耗的汞盐量可计算青霉素的含量药物分析（第七版）第