第四章 兽药残留量的检验

4.1兽药与兽药残留（研究背景、兽药残留产生的原因、类型、危害）4.2水产品中氯霉素的检验（对虾中氯霉素含量的竞争性ELISA法检测）4.3猪组织中盐酸克伦特罗的检验（猪组织中盐酸克伦特罗的GS/MS法检测、猪组织中盐酸克伦特罗的ELISA法检测）第四章兽药残留量的检验内容要点：兽药：预防和治疗畜禽疾病的药物；促进生长、提高生产性能、改善动物性食品的品质；也包括一些化学的、生物的动物保健品或饲料添加剂。现代化的动物集中饲养，经常需要使用抗生素或其他药物来控制可能爆发的疾病，同时有效使用兽药可以在很大程度上提高动物对饲料的利用率。4.1兽药与兽药残留1、研究背景1、研究背景兽药的使用极易造成动物源食品中有害物质的残留，特别是由于养殖人员对科学知识的缺乏以及一味地追求经济利益，致使滥用兽药现象在畜牧业中普遍存在。兽药残留：“兽药在动物源食品中的残留”的简称，是指动物产品的任何可食部分所含兽药的母体化合物及（或）其代谢物，以及与兽药有关的杂质。兽药残留直接危害人体健康，影响畜牧业的发展和生态环境。随着人们对动物源食品由需求型向质量型的转变，兽药残留已逐渐成为全世界关注的一个焦点。抗生素类：氯霉素、四环素、土霉素、青霉素等；磺胺类：磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶等；呋喃类：呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等；激素和β-兴奋剂：盐酸克伦特罗、己烯雌酚、孕酮等；抗寄生虫类：左旋咪唑、苯丙咪唑、克并咪唑、克球酚、吡喹酮等。2、兽药残留的类型非法使用违禁或淘汰药物；不遵守休药期规定；滥用药物；违背有关标签的规定；屠宰前用药。3、兽药残留产生的原因毒性损害;引发过敏反应；导致病原菌产生耐药性;破坏微生态平衡，导致二重感染;致畸、致癌、致突变作用;影响生态环境；影响畜牧业的发展。4、兽药残留的危害筛选方法检测和确认方法：理化检验技术（GC、HPLC、TLC、GC-MS、HPLC-MS等）。微生物检验（微生物抑制试验）免疫法（免疫检测试剂盒）阳性5、兽药残留的分析方法兽药残留的检验分析方法包括筛选、检测和确认。GC灵敏度较高，但易出现假阳性、阳性结果需进一步确证；HPLC操作简单，但灵敏度不高；ELISA简单、快速、灵敏度，但容易产生假阳性，一般只适用进行样品粗筛，阳性结果需进行确证；目前灵敏度较高、确证率较好的是GC/MS、GS-MS/MS。5、兽药残留的分析方法氯霉素（chloramphenicol，CAP）是由委内瑞拉链丝菌产生的一种光谱抗生素。CAP对造血系统有毒性反应，是一种禁用药。4.2.1概述氯霉素的检测方法主要有：微生物筛选法、GC（ECD）、HPLC（UV）、GC-MS、GS-MS/MS、ELISA以及RIA等。4.2水产品中氯霉素的检验酶联免疫吸附试验（ELISA）竞争性ELISA法的基本原理竞争性ELISA法检测对虾中氯霉素含量的实验设计（课程实验）分析和讨论4.2.2对虾中氯霉素含量的竞争性ELISA法检测1、酶联免疫吸附试验（ELISA）4.2.2对虾中氯霉素含量的竞争性ELISA法检测免疫检测技术是以抗原抗体的特异性、可逆性结合反应为基础，结合一些生化或物理方法作为信号显示或放大系统而建立的测定方法。酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linkedimmunosorbentassay,ELISA）是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化有机地结合起来的一种免疫检测技术，其基础的是抗原与抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。1、酶联免疫吸附试验（ELISA）基本原理：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶活性；③结合物与相应的抗原或抗体反应后，结合的酶仍能催化底物生产有色物质生成，而颜色的深浅可定量抗体或抗原的含量。1、酶联免疫吸附试验（ELISA）图4-2竞争性酶联免疫吸附试验法测抗原的基本原理示意图2、竞争性ELISA的基本原理（以竞争性ELISA法测定氯霉素抗原为例）酶标抗原与样品或标准体中的非标记抗原（氯霉素）具有相同的与抗体结合的能力，两者竞争与固相载体包被的抗体结合。洗涤多余的酶标抗原，加酶反应的底物显色后根据颜色的深浅进行定量。在整个反应当中，样品中氯霉素含量越多，反应显色就越淡。反之，样品中氯霉素含量越少，则显色越深。2、竞争性ELISA的基本原理（以竞争性ELISA法测定氯霉素抗原为例）为什么样品中氯霉素含量与显色呈反比？实验方案设计：为了达到某种特定的目的，使用多种实验试剂、仪器和设备，按照可行的实验原理，列出实验的操作顺序、确定各步骤的操作方法，列出必须的注意事项。3、竞争性ELISA检测对虾中氯霉素含量的实验设计4.2.2对虾中氯霉素含量的竞争性ELISA法检测1）实验目的：进一步学习酶联免疫试验法的基本原理和实验方法，确实掌握酶联免疫吸附试验法测定虾肉中氯霉素含量的基本原理、实验方法和结果的分析。3、竞争性ELISA检测对虾中氯霉素含量的实验设计4.2.2对虾中氯霉素含量的竞争性ELISA法检测图4-2竞争性酶联免疫吸附试验法测抗原的基本原理示意图2）实验原理3、竞争性ELISA检测对虾中氯霉素含量的实验设计氯霉素检测试剂盒4.2.2对虾中氯霉素含量的竞争性ELISA法检测氯霉素检测试剂盒的组成：微量测试孔；氯霉素标准溶液；10倍浓缩萃取稀释液；10倍浓缩洗涤液；氯霉素酶标记物；底物溶液；反应终止液。3、竞争性ELISA检测对虾中氯霉素含量的实验设计3）主要试剂：氯霉素酶联免疫检测试剂盒。4）主要仪器：简易的萃取设备、氮吹仪、离心机、酶标分析仪。3、竞争性ELISA检测对虾中氯霉素含量的实验设计4.2.2对虾中氯霉素含量的竞争性ELISA法检测图4-2酶标仪4、实验步骤（1）实验准备①从冰箱取出试剂盒，将氯霉素标准溶液、浓缩萃取稀释液、浓缩洗涤液、酶标记物、底物溶液及微量测试孔条置于室温下回温30min。②配制原倍萃取稀释液及洗涤液：用蒸馏水将10倍浓缩萃取稀释液及浓缩洗涤液分别按1:9的比例稀释。4.2.2对虾中氯霉素含量的竞争性ELISA法检测（2）样品制备①将3g虾肉剪碎后放入50mL带塞离心管中，加入6mL乙酸乙酯，用均质机均质约1min，再震荡约30s。②离心（3000rpm，10min），取2mL上清液至玻璃管中，于50℃下氮气吹干。③于上述玻璃管中加入正己烷2mL，先将残余物完全溶解后，再加入1mL原倍萃取稀释液，震荡约30s。④离心（3000rpm，10min），用吸管吸去上层液及中间乳化层部分，弃掉，取下层液备用。⑤若乳化现象较严重，则先将大部分上层液取出后，再将玻璃管置入80℃水中，隔水加热约5～10min。4.2.2对虾中氯霉素含量的竞争性ELISA法检测（3）操作步骤①取一定的微量测试孔条，于适当微孔中分别加入100μL标准溶液。②在另外的微孔中加入100μL已完成前处理的样品溶液。③在每一微孔中加入50μL酶标记物。④轻敲盘子四周，使其充分混合后室温下避光静置温育1h。⑤甩掉反应液，再将洗液加满每一微孔后甩掉，重复3次。⑥最后一次甩掉洗液后，在吸水纸上拍干。⑦每一微孔中加入底物溶液100μL，轻敲盘子四周。⑧于室温下避光静置温育20min。⑨于每一微孔中加入100μL反应终止液，用酶标仪于波长450nm下判读。4.2.2对虾中氯霉素含量的竞争性ELISA法检测5、结果处理①所测得的标准吸光值和样品吸光值（B）除以第一个标准（零标准）的吸光值（B0）再乘以100。②以B/B0的百分数值为纵坐标，以标样浓度（ppb）为横坐标，绘制标准半对数曲线。③根据每个样品的B/B0的百分数值就可从曲线上读出相对应样品的浓度（ppb）。④根据标准曲线所得出的样品浓度乘以样品稀释倍数计算出样品中氯霉素的实际浓度，最后的结果用“μg/kg”单位表示。4.2.2对虾中氯霉素含量的竞争性ELISA法检测6、注意事项•使用前先将取出置于室温下，回温30min。回温后，取出所需微量测试孔条，将剩余板条立即放回铝箔袋中用胶带封好，置于4℃保存。•浓缩萃取稀释液和浓缩洗涤液使用前必须稀释。•每次吸取不同的液体时一定要换移液枪的吸头。•加样时必须小心勿溅出微孔外，以免造成其他微孔的污染，加样品或试剂时枪头请勿接触微孔，不可产生气泡。•洗涤必须充分，重复3次。•温育时，要盖上塑料片或标签纸，置于暗处，温育时间不够不要随意取出；显色后尽快比色。•试剂盒较贵且量很少，准确量取，不要造成浪费。7、分析与讨论酶联免疫吸附试验检测试剂盒应该如何选择？加底物进行温育反应后不显色的原因？洗涤不彻底会对结果产生怎样的影响？为什么？标准曲线偏离（线性不好，包括斜率偏大和偏小）的原因有哪些？样品吸光值高于标准吸光值的原因？4.2.2对虾中氯霉素含量的竞争性ELISA法检测盐酸克伦特罗（clenbuterol，CLB）是一种选择性β2-肾上素受体激动剂（简称β-兴奋剂），是国家按兴奋剂管理的药品，为人、畜呼吸系统药物（氨哮素、克喘素）。CH2CHNHCCH3CH3CH3HOClNH2Clα-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇盐酸盐4.3.1盐酸克伦特罗概述盐酸克伦特罗可促进动物生长，加速脂肪转化，提高瘦肉率，被俗称为“瘦肉精”。4.3猪组织中盐酸克伦特罗的检验4.3.1盐酸克伦特罗概述盐酸克伦特罗加速脂肪转化？胰高血糖素促甲状腺激素cAMP脂肪酶激活激活非法使用盐酸克伦特罗作为饲料添加剂，使用量大（是治疗剂量的5-10倍），使用时间长（持续添加时间一般3周以上），代谢慢，因而容易在动物体内（尤其是眼、肺、肝、肾）残留。盐酸克伦特罗通过食物链进入人体，产生蓄积中毒，如头晕、乏力、心律失常等。因此，国内外已经禁止β-肾上腺素激动剂在动物生产中的应用。4.3.1盐酸克伦特罗概述克伦特罗的检验方法：HPLC、GC-MS、毛细管区带电泳法和免疫分析法。感官识别：健康肉淡红色，肉质弹性好，无“出汗”现象；“问题肉”特别鲜红，脂肪非常薄，瘦肉纤维疏松，有“出汗”现象。4.3.1盐酸克伦特罗概述GB/T5009.192-2003《动物性食品中克伦特罗残留量的测定》，提出了从ELISA筛选、HPLC定量到GC-MS确证和定量对动物性食品中克伦特罗残留量进行监测。4.3.2猪组织中盐酸克伦特罗的检验—GS/MS法基本原理：固体样品剪碎，用高氯酸溶液匀浆。若为液体试样，则加入高氯酸溶液，进行超声加热提取，用异丙醇+乙酸乙酯（40+60）萃取，有机相浓缩，经弱阳离子交换柱进行分离，用乙醇+浓氨水（98+2）溶液洗脱，洗脱液浓缩，经N,O-双三甲级硅烷三氟乙酰胺衍生后于气质联用仪上进行测定，以美托洛尔为内标，进行定量。GB/T5009.192-2003《动物性食品中克伦特罗残留量的测定》第一法——GC/MS法。4.3.3猪组织中盐酸克伦特罗的检验—ELISA法基本原理：微孔板包被有针对克伦特罗IgG的抗抗体；加入克伦特罗抗体，经过温育和洗涤后；加入酶标记物、标准或样品溶液，克伦特罗与酶标记物竞争与抗体结合；没有连接的克伦特罗酶标记物在被洗涤除去；加入酶底物和发色剂并且温育，结合的酶标记物将无色的发色剂为蓝色的产物，加入反应终止液使颜色有蓝转变为黄色。在450nm处比色测定。GB/T5009.192-2003《动物性食品中克伦特罗残留量的测定》第三法——GC/MS法。酶联免疫实验设计4.3.3猪组织中盐酸克伦特罗的检验——ELISA法4.3.3猪组织中盐酸克伦特罗的检验——ELISA法实验的关键操作：①试剂盒的选择和准备；②试样的处理；③加样；④洗涤；⑤比色。1）试剂盒的选择和准备固相载体：吸附性能，孔底透明度，板、孔性能差异；包被物：纯度；储存条件：2-8℃；室温平衡：试验用试剂应提前1-2h从冰箱中取出，待温度与室温平衡后使用；及时保存：试剂完毕后不需用的部分应及时放回冰箱保存。4.3.3猪组织中盐酸克伦特罗的