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实验二十三病毒核酸检测常用技术（TechniquesofDetectingNucleicAcidofVirusesinCommonUse）近年来随着分子生物学的发展，基因检测技术在微生物学实验室诊断中也取得了长足的进展。由于部分病原微生物的基因组已成功地被克隆并进行了核苷酸序列测定，因此根据病原微生物的基因特点，应用分子生物学技术检测样品中有无相应病原微生物的核酸，从而可以特异、灵敏地判定标本中是否含有相应的病原微生物。在微生物学的研究及感染性疾病的诊断中，最常使用的微生物核酸检测技术有PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术，现对病毒核酸（DNA、RNA）的分离、PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术的基本原理、操作方法、应用及影响因素等进行概述。实验1PCR检测传染性喉气管炎病毒核酸【目的要求】通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸（DNA）的分离与PCR技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。【基本原理】鸡传染性喉气管炎(Infectiouslaryngotracheitis,ILT)是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科的喉气管炎病毒(InfectiouslaryngotracheitisVirus,ILTV)引起的一种急性上呼吸道传染病,常表现呼吸困难、产蛋鸡产蛋下降和死亡,是危害养鸡业发展的重要疫病之一。但在临诊上极易与其它一些呼吸道疾病相混淆,如禽流感、新城疫、传染性支气管炎、支原体感染等。常规检测ILTV的方法有病原分离鉴定和血清学试验,这些方法虽经典，但费时且敏感性差,不能检测亚临床感染,而传染性喉气管炎潜伏感染是疾病的一种重要表现形式。聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是目前比较快速、敏感、特异的检测手段，已被广泛应用在病毒核酸检测方面。本实验以PCR方法检测鸡传染性喉气管炎病毒核酸为例，对PCR方法进行介绍。PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93～94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍（图23-1）。图23-1PCR基本原理示意图本实验是将被检样品中ILTV颗粒经裂解、变性后，分离ILTV—DNA。选择鸡传染性喉气管炎病毒的TK基因保守序列设计引物，由于引物与鸡传染性喉气管炎病毒的TK基因存在着特异的互补性，当加入DNA聚合酶后，就会在引物的引导下合成该段基因，该基因片段通过人工扩增后，经含溴乙锭的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可显示橙红色ILTV—DNA条带，根据片段大小来判定标本中鸡传染性喉气管炎病毒的存在。【器材准备】1．病毒裂解液：醋酸钠1.7g，EDTA钠盐4.65g，20mg/ml蛋白酶K2.5ml，100g/LSDS10ml，DEPC三重蒸馏水加至50ml。2.3mol/L醋酸钠缓冲液(pH5.2)，酚/氯仿/异戊醇混合液(25：24：1)，无水乙醇及70％乙醇。3.2.5mmoldNTPs：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM。4.10×PCRBuffer，TaqDNA聚合酶。5.DNA分子量标准。6.上样缓冲液：2.5g/L溴酚蓝、400g/L蔗糖水溶液。10mg/ml溴乙锭(EB)(具致癌性，操作时应戴手套)，琼脂糖。7.50×TAE缓冲液：242gTris，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）加三蒸水定容到1000mL。使用液为1×。8.ILTV北京E2株、ILTV-DNA可疑组织样品、ILTV-DNA阴性组织样品等。9.引物序列:参考已发表的ILTV的TK基因序列,设计并合成了一对引物,其序列如下：引物P1：5’-TTCGAGAACGATGACTCCG-3’；引物P2：5’-ATAGTCATCTGAACTTCCGC-3’。10.仪器：台式高速离心机、PCR扩增仪、电泳仪、水平式电泳槽、紫外透射反射分析仪、微量加样器、Eppendorf管与吸头等。【实验步骤】1.病毒核酸的分离（1）取ILTV-DNA可疑组织样品上清液200μL、病毒裂解液20μL于Eppendorf管中，60℃水浴1h，同时设ILTV北京E2株、ILTV-DNA阴性组织样品对照。（2）加酚/氯仿/异戊醇混合液200μL，上下颠倒混匀，14000rpm离心5min，吸上清液于另一新的Eppendorf管中。（3）加1/10体积的3mol/L醋酸钠缓冲液(pH5.2)及2倍体积的无水乙醇，-20℃过夜。14000rpm离心15min，弃上清液。（4）加70％乙醇至Eppendorf管2/3处，混匀，洗涤沉淀。14000rpm离心15min，弃上清液，室温中使乙醇挥发。2.加样及PCR扩增（1）按以下次序将各成分加入0.5ml灭菌Eppendorf管中。10×PCRbuffer5μl2.5mMdNTPs4μl引物P1（25pmol/μL）2μl引物P2（25pmol/μL）2μlTaqDNA聚合酶（5U/μl）0.5μl模板液（病毒核酸的分离液）1μl加ddH2O至50μl（2）将上述混合液稍加离心，调整好反应程序，立即置PCR仪上，执行扩增。一般在94℃预变性3min，进入循环扩增阶段：94℃60s→58℃30s→72℃60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。3.电泳检测（1）将倒胶槽两端用透明胶带封闭并放置在水平的台面上，放好梳板，使梳板齿下沿距倒胶槽板1mm。（2）配制合适浓度的琼脂糖凝胶，如配制1.2％的凝胶，则称取琼脂糖1.2g于三角瓶中，加入100ml1×TAE电泳缓冲液，置微波炉中加热煮沸后以蒸馏水补足体积至100ml，迅速混匀，待冷至60℃左右时，加入100μL0.5mg/ml的EB液，充分混匀。倒胶至倒胶槽内，使厚度为3～5mm，排除气泡后待胶完全凝固，撕去两端胶带。（3）将倒胶槽置电泳槽中，加入1×TAE电泳缓冲液使其没过胶面2～3mm，轻轻拔出梳板。（4）加样：取2μL上样缓冲液于Parafilm膜上，加入PCR产物5μL，混匀后，加入点样孔中，不要溢出孔外。同时设DNA分子量标准。（5）电泳：样品在负极端，接通电源，5V/cm恒压电泳30～60min即可。（6）检测：电泳结束，关闭电泳仪电源，取出倒胶槽，将电泳完毕的琼脂糖凝胶放在紫外灯300nm下观察，可见桔红色明亮带，根据电泳条带的位置判断结果。4.结果判定在阳性对照孔出现相应扩增带、阴性对照孔无此扩增带时判定结果。若样品扩增带与阳性对照扩增带（约265bp）处于同一位置，则判定为ILTV-DNA阳性，否则判定为阴性。【注意事项】1.所有实验结果都有成功或失败，实验的失败可能是应该出结果而没有出，我们把它称作假阴性，不该出结果而出了结果我们把它称为假阳性。PCR实验中最常见的问题就是假阴性和假阳性问题。（1）假阴性：出现假阴性结果最常见的原因有TaqDNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统欠妥当；循环次数不够。为了防止假阴性的出现在选用TaqDNA聚合酶时，要注意用活力高、质量好的酶。同时在提取PCR模板时，应特别注意防止污染抑制酶活性物质（如酚、氯仿）的存在。尽管TaqDNA聚合酶对模板纯度要求不高，但也不允许有破坏性有机试剂的污染。保证引物的3’端与靶基因的互补。PCR反应的各温度点的设置要合理。（2）假阳性：PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生，所以污染是PCR假阳性的主要根源。污染的原因可能有：①样品间交叉污染。样品污染主要有收集样品的容器被污染，或样品放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样品而造成相互间交叉污染；样品核酸模板在提取过程中，由于移液器污染导致样品间污染；有些微生物样品尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。②PCR试剂的污染。主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于移液器、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。③PCR扩增产物污染。这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳性。还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染移液器的反复吸样都可形成气溶胶而污染。④实验室中克隆质粒的污染。在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见，因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。为了避免因污染而造成的假阳性，PCR操作时采取如下措施：①合理分隔实验室。将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开，最好能划分①标本处理区；②PCR反应液制备区；③PCR循环扩增区；④PCR产物鉴定区。②移液器：移液器污染是一个值得注意的问题，由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入移液器内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。③预混和分装PCR试剂：所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存，以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂与反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。④防止操作人员污染，手套、吸头、小离心管应一次性使用。⑤设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。⑥减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。⑦选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部，开管动作要轻，以防管内液体溅出。2.注意个人防护和环境保护，电泳中用到的EB（TimesNewRoman体）可诱发基因突变，试验中被EB污染的物品要有专用收集处，并通过焚烧作无害化处理。3.实验用品应专用，实验前应将实验室用紫外线照射以破坏残留的DNA或RNA。总而言之，PCR的条件是随系统而异的，并无统一的最佳条件，先选用通用的条件扩增，然后可以通过稍稍改变各参数，使反应条件得到优化，以取得优良的特异性和产率。【实验报告】1.实验结果（1）你所做的PCR实验阳性对照是否出现相应扩增带?如果有扩增带，请对你的试验结果进行描述。如果失败，请分析其原因。2.思考题（1）PCR技术的基本原理？（2）影响PCR实验成功的因素有哪些？（3）PCR检测中出现假阳性，可能导致的因素有哪些？（4）根据实验过程中的体会，总结如何做好PCR实验？关键因素有哪些？实验2RT-PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸【目的要求】通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸（RNA）的分离与RT-PCR技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。