第六章 干细胞工程

干细胞工程干细胞（stemcell）:是具有自我更新、高度增殖和多项分化潜能的细胞群体，是动物有机体和各种组织器官的起源细胞．什么是干细胞?骨髓干细胞神经干细胞干细胞研究成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生命学科研究领域，1999年干细胞研究被美国《科学》杂志评为1999年度世界十大科学之冠，2000年干细胞研究再次被《科学》杂志评为该年度世界十大科学成就之一。组织工程是以干细胞研究为基础发展起来，它有望解决临床上急需的人工组织与器官问题，进展极为迅速，已经成为干细胞应用的主要方向。干细胞有几个主要特征干细胞本身不是终末分化细胞干细胞能无限增殖分裂干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运—保持干细胞或分化为特定细胞干细胞的分类１按分化潜能大小来分类:全能干细胞(Totipotentstemcell):它具有形成完整个体的分化潜能。如受精卵，胚胎干细胞多能干细胞(pluripotentstemcell):具有分化出多种组织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。如骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十二种血细胞专能干细胞(multipotentstemcell):这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等２根据来源来分:来源于胚胎---胚胎干细胞ESC（EmbryonicStemCell）胚胎生殖细胞EGC（EmbryonicGermCell）来源于成体---成体组织来源的干细胞ASC（Adult-derivedStemCell）３根据干细胞组织发生的名称进行分类:胎胎干细胞造血干细胞骨髓间质干细胞肌肉干细胞成骨干细胞内胚层干细胞视网膜干细胞胰腺干细胞干细胞的转分化和去分化1．干细胞的转分化：一种组织类型的干细胞在适当条件下分化为另一种组织类型的细胞的过程称干细胞的转分化。实验：C57BL/6J♂成年小鼠造血干细胞WBB6F/J-KitW/KitW-V♀鼠(亚致死剂量同位素照射)在♀鼠的神经胶质细胞中检测到Y染色体.即♂鼠的造血干细胞移植到♀鼠中分化为脑星形胶质细胞。移植分离3天2．干细胞去分化：一种干细胞向其前体细胞的逆向转化称干细胞去分化。实验：成体鼠造血干细胞鼠卵泡的内细胞团表达胎鼠的珠蛋白基因→参与胚胎造血系统的发育。注入分化状态逆转3.干细胞的可塑性(1)干细胞的横向分化：在干细胞移植时，供体干细胞在受体中通常分化为与其组织来源一致的细胞。但有时供体干细胞会分化出与其组织来源不一致的其它细胞，这种现象称干细胞横向分化(trans-differentiation)。干细胞横向分化表明成体干细胞被移植入受体中具有很强的可塑性。为干细胞治疗提供了可能。(2)实验：小鼠肌肉干细胞→体外培养5天＋少量骨髓间质细胞接受致死量辐射的小鼠中各种血细胞系。植入分化胚胎干细胞•当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。•进一步说，胚胎干细胞（ES细胞）是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。•ES细胞的研究可追溯到上世纪五十年代，由于畸胎瘤干细胞（EC细胞）的发现开始了ES细胞的生物学研究历程。胚胎干细胞1981年Evans和Kaufrnan及Martin首次由小鼠中分离得到鼠的胚胎干细胞。至今已分离得到的胚胎干细胞物种有：金黄地鼠（1988）、貂（1993）、猪（1994，1997）、鸡（1996）、恒河猴（1995）、绒猴（1996）分离得到人的胚胎干细胞（1998）分离得到人的胚胎生殖细胞（1998）人多能(pluripotent)干细胞：JamesA.Thomson在Wisconsin大学领导一个研究小组从人胚胎组织中培养出了干细胞株。方法：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取innercellmass细胞，建立细胞株。经测试这些细胞株的细胞表面marker和酶活性，证实它们就是胚胎干细胞。用这种方法，每个胚胎可取得15－20个细胞用于培养。JohnD.Gearhart在JohnsHopkins大学领导另一个研究小组也从人胚胎组织中建立了干细胞株。方法是：从受精后5－9周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞(primordialgermcell)。由此培养的细胞株，证实具有全能干细胞的特征。人胚胎干细胞的获得(一)获得途径：1.从早期胚胎获得2.从原始生殖细胞获得3.从移植细胞(克隆细胞)获得1．从早期胚胎获得美国Thompson研究小组是从囊胚期胚胎的内细胞团中获得胚胎干细胞：体外受精卵囊胚期去除滋养层→内细胞团得5株干细胞系32代(8个月)保持未分化状态。传代培养发育免疫切除法2．从原始生殖细胞获得gearhart小组：流产胎儿性腺嵴原始生殖细胞获得5个多能干细胞系7个月不分化。思路：原始生殖细胞是未分化细胞。培养分离培养3．体细胞移植分化细胞核(乳腺、皮肤细胞)去核卵细胞→杂合细胞发育成囊胚胚胎干细胞成体(如多利羊)。分离发育移植刺激干细胞的体外培养由于干细胞数目少，应用时需先在体外进行非分化性增殖，再进行诱导分化。不同组织来源的干细胞的培养条件不尽相同。1·培养条件：需要许多生长因子和间质细胞共培养。如Brustle等在体外培养了鼠的ES细胞。分离ES细胞培养培养生长增殖保持分化潜能。停止供给生长因子，ES细胞分化为寡树突细胞或星状细胞。EGF培养基FGF2+PDGFFGF2培养基2·分化诱导在应用前还需依据靶组织类型对培养干细胞进行定向分化诱导。分化诱导需了解：①干细胞发育有关的信号调节；②干细胞发育的微环境。胚胎干细胞的分化潜能胚胎干细胞是全能(多能)性干细胞，具有分化为各种组织细胞的潜能。实验1：移植实验人胚胎干细胞小鼠体内畸胎瘤(良性)→有三个胚层产生的组织：移植发育胃上皮(内胚层)骨、软骨、平滑肌、横纹肌等(中胚层)神经表皮、神经节复层磷状上皮等(外胚层)ES细胞的体外定向诱导分化原理：选择适当的诱导剂的诱导模式，通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤等，使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化。ES细胞的体外定向诱导分化方法：经悬浮培养或悬滴培养，使ES细胞形成EB(类胚体)，再将EB消化成单细胞贴壁培养，并于不同的培养阶段添加不同种类和不同浓度的化学物质、条件培养液或细胞因子等，直接促进ES细胞定向分化为某种特殊类型的细胞，或培养条件对某些类型的细胞分化起抑制作用，从而高效诱导目的细胞的分化。分化诱导因素:化学诱导物(视黄酸、DMSO等）细胞因子（骨形成蛋白、视经生长因子等）转录因子(Oct-4等）诱导分化方法:单层ES细胞诱导分化EB培养和诱导分化ES细胞的生物学特性1.各种动物的ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。2.ES细胞与卵圆柱期（eggcylinderstage）胚胎外胚层和胎儿生殖峙的原始生殖细胞类似，而与ICM细胞有差异。3.细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖体和线粒体，核型正常，保留了整倍体性质。正常ES细胞染色体正常，如发生异常则其很难发育分化形成动物个体。•4.ES细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。•5.ES细胞增殖迅速，每18－24h分裂增殖1次。•6.此外，其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征。ES细胞生物学特性细胞形态结构及核型细胞的高度分化潜能碱性磷酸酶的表达胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达形态和生化特征1.形态：细胞体积小，核大，1~多个核仁。离体培养可产生密集的多细胞克隆。2.生化特征：端粒酶活性高。3.干细胞物理特性：如干细胞对Hoechst33324和Rhodamine123染料不着色。4.干细胞表面免疫原性：一般表达胚胎早期的表面抗原，而且有种属差异。如小鼠胚胎干细胞表达胚胎阶段性特异抗原-1(SSEA-1)，不表达SSEA-3或SSEA-4；人胚胎干细胞表达SSEA-3或SSEA-4。ES细胞的高度分化潜能ES细胞的全能性是其区别于成纤维细胞等体细胞的显著特点：1.ES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。2.在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，悬浮培养中：“简单类胚体”“囊状胚体”细胞分化物。•3.ES细胞可进行诱导分化•*用RA（维生素A酸或视黄酸）作诱导90％以上的ES细胞分化为神经胶质细胞，•*聚集培养的ES细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩的心肌细胞。•*将ES细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，其细胞组成可代表3个胚层细胞。•*用ES细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重构胚和动物个体。碱性磷酸酶的表达许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶（AKP）表达，小鼠的EC细胞和ES细胞中均含有丰富的AKP。而在已分化的EC细胞和ES细胞中AKP呈弱阳性或阴性。猪、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈阳性。因此，AKP常用来作为鉴定EC细胞或ES细胞分化与否的标志之一。胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原（SSEA－1）。在胚胎的原始外胚层细胞、ES细胞、EC细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到SSEA－1的表达。小鼠SSEA－1的表达自8一细胞期开始，直到原始外胚层形成期。早期囊胚ICM细胞全部呈强阳性，晚期囊胚中部分ICM呈强阳性，部分呈弱阳性，少部分为阴性。因此，SSEA也常作为ES细胞鉴定的一个标志。胚胎干细胞的鉴定--细胞的形态结构--核型分析--碱性磷酸酶（AKP）染色--SSEA-I免疫荧光标记--分化能力检测体外分化试验体内分化试验嵌合体形成试验核移植试验ES细胞形态学鉴定依ES细胞的形态结构（胞体体积小，核大、有一个或几个核仁）和生长特性（呈克隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，界限不清）对ES细胞进行初步鉴定。核型分析ES细胞具有正常二倍体核型，在体外培养条件下，稳定细胞系的细胞染色体数目和核型保持与来源动物品系一致，可用核型分析进行检验。碱性磷酸酶（AKP）染色*常用快绿（FastGreenStaining)染色法，对照以已建系ES细胞（或小鼠的脱带桑椹胚或囊胚）作为阳性对照，作用液中不含α-萘酚磷酸钠为阴性对照。*结果判定阳性对照ES细胞染成棕色，阴性对照无色。小鼠3．5日龄胚胎ICM为强阳性。SSEA-I免疫荧光标记第1抗体，SSEA－1（鼠抗ES细胞单克隆抗体），1:100稀释；第2抗体，羊抗鼠1：10稀释;封闭液，羊抗兔lgG。步骤：①杜氏PBS洗3次,2％Triton作用20min；②再以杜氏PBS洗3次,封闭液中置20min；③以杜氏PBS洗3次，加第1抗体于4℃过液；④以杜氏PBS洗3次，加第2抗体于30℃温箱置30min；⑤再以杜氏PBS洗3次后用甘油PBS封片。样本在激光共聚焦图像系统下观察,结果依细胞是否出现荧光作出判断。分化能力检测体外分化试验体内分化试验嵌合体形成核移植胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES细胞）也可被称为多能干细胞（pluripotentstemcell，PSC），是胚胎或原始生殖细胞经体外抑制分化培养后筛选出的具有发育全能性的细胞。其可以定向诱导分化为几乎所有种类的细胞，甚至形成复杂的组织和器官，其建系、体外扩增、定向诱导分化、调控机制、细胞性能、组织重构等方面的研究将在未来的人体发育、基因功能、药物开发、细胞治疗和组织器官替代治疗中发挥重要作用，并成为组织器官移植的新资源。目前胚胎干细胞的研究与应用51源于胚胎干细胞的细胞已能或可能治疗许多疾病神经细胞心肌细胞B型胰岛细胞软骨细胞白细胞皮肤细胞肝细胞骨细胞视细胞骨骼肌细胞帕金