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1根据临床统计，25%的生理缺陷、30%的儿童死亡都是由遗传疾病引起的。随着分子生物学和分子遗传学等学科的飞速发展，人们对于遗传疾病的分子机理有了深入的了解，已经知道人体基因的缺失、重复或突变，基因的异常表达等都会造成遗传疾病。2白化病3白化病4豁唇5并指症6基因突变镰刀型贫血症是一种异常血红蛋白病。一旦缺氧，患者红细胞变成长镰刀型，血液的粘性增加，引起红细胞的堆积，导致各器官血流的阻塞。而出现脾脏肿大，四肢的骨骼、关节疼痛，血尿和肾功能衰竭等症状，病重时，红细胞受机械损伤而破裂产生溶血现象，引起溶血性贫血甚至造成死亡。血红蛋白四聚体8由于每一个基因对人的正常功能的影响都是复杂的，所以一种基因的变化可能会引起多种症状。例如，如果突变造成了某种酶活性的改变，既可能引起某种有毒底物的堆积，也可能造成某种正常细胞生活所必需的产物的缺乏。9多基因病多基因病也与外界环境和心理因素有关，遗传因素所占的程度称之为遗传度。如：哮喘病遗传度为80％、精神分裂症为80％、高血压遗传度为62％、冠心病遗传度为65％、糖尿病遗传度（幼年型）为75％、（老年型）为35％、唇裂＋腭裂遗传度为76％10第一节基因诊断11基因诊断一、概念和特点概念：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接探测基因结构及其表达水平，从而对疾病作出诊断的方法。分为DNA诊断和RNA诊断两类。12分子诊断遗传性疾病的诊断羊水和胎盘绒毛膜检测13探针杂交分析法•用途：用于诊断已知基因突变的疾病。•探针：人工合成两种寡核苷酸片段，长约16－19个单核苷酸；其中一种是正常的，另一种含有一个突变的单核苷酸。探针可用同位素、生物素、地高辛等标记。•样本：血液或羊水细胞。14待测样品（血细胞或羊水细胞）提取分离DNA限制性内切酶酶切琼脂糖凝胶电泳转膜，与探针杂交放射自显影或显色15特定载体上密集的大量探针与荧光标记的样品杂交。根据杂交信号强弱判断基因表达强度。16PCR为基础的诊断技术•PCR－单链构象多态性（PCR－SSCP）如果DNA分子中发生了突变，他的单链构象就会发生改变，与正常的DNA单链相比，电泳的迁移率不同，即使只有一个核苷酸的差异，也能在电泳中区分开来。17PCR-SSCP的应用•检测由于基因突变所引起的疾病如遗传病、肿瘤。18PCR－变性梯度凝胶电泳(Denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)双链DNA相差一个碱基，可引起解链温度的细微变化，在梯度变性的SDS-PAGE中，迁移率不同，籍此检测是否发生点突变。19×MstⅡ酶切位点（CCTGAGGAG）5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析20+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析21第二节基因治疗的历史与现状1．基因治疗概念随着对遗传疾病致病机理研究的深入，人们自然就想到如果能够使变异基因和异常表达的基因变成正常基因和正常表达基因，那么就可从根本上治愈遗传疾病，这就是基因治疗的基本思路。22基因治疗的概念：向靶细胞或组织中引入外源DNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。232．基因治疗的历史20世纪80年代初期，美国的安德森博士首先阐明了基因治疗的前景及其发展方向。1984年，美国研究者Kohn等将载有腺苷脱氨酶（ADA）基因的病毒感染非灵长类动物，实验表明，该基因在动物体内的表达持续了数月。24基因治疗方式•基因补偿：以正常基因校正或者替代缺陷和异常的基因•RNA技术：封闭有害基因的表达•自杀信号途径：引发细胞调亡，治疗癌症•共刺激途径：刺激免疫系统251990年，美国批准了第一例临床基因治疗申请。患者为四岁女孩，由于缺失腺苷脱氨酶（ADA)基因而患有严重综合性免疫缺陷症，研究者（WilliamFrenchAnderson)将ada基因导入患者的淋巴细胞，然后将经过改造的淋巴细胞回输到患者的体内，治疗取得了成功。2627治疗基本步骤:ADA基因+逆转录病毒载体导入患者淋巴细胞体外扩增回输病人体内淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10%维持免疫系统功能,改善病人症状28腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID)•病因:•淋巴细胞缺乏ADA酶腺苷、dATP堆积破坏免疫功能患儿很少活到成年第一个基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH)治疗策略：淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10%维持免疫系统功能改善病人症状29AshantideSilva,Now13,wasthefirstpatienttobetreatedwithgenetherapy.•重症联合免疫缺陷的基因治疗腺苷脱氨酶基因治疗(1990)3031321991年美国科学家对50位黑色素瘤患者进行了基因治疗，把外源的肿瘤坏死因子（TNF）基因导入患者体内，从而达到杀死肿瘤细胞的功能，研究也取得了成功。33三、基因治疗实例经过11年的不懈研究，密歇根大学医学院的研究人员成功培育出了新的听觉毛细胞，并且恢复了聋成年天竺鼠的听力。这项研究是寻找治疗人类耳聋新方法的一个重要步骤。34研究人员将一种叫做Atoh1的基因插入到非感觉的上皮细胞中，这种细胞在成年的耳聋天竺鼠的内耳中仍然存在。已经知道Atoh1基因是听觉毛细胞发育的一种关键调节因子。8周后，研究人员发现用Atoh1处理过的动物内耳中形成了新的听觉毛细胞。听力测试表明受试动物开始恢复听觉。•Atoh1DirectstheFormationofSensoryMosaicsandInducesCellProliferationinthePostnatalMammalianCochleaInVivoMichaelC.Kelly,QingChang,AlexPan,XiLin1,,andPingChen3536这项研究揭示了基因治疗方法的潜力，但是同时也表现出了基因治疗的有限性，产生的毛细胞可以像正常细胞那样产生电信号，并且与神经元联系；然而当幼年小鼠使用基因治疗后两周，Atoh1基因的效应就会减弱。相关研究成果刊登在了5月9日的国际杂志JournalofNeuroscience上。37四川大学华西医学中心研究人员采用反义核酸阻断生物钟基因表达的方法，对小鼠进行戒毒实验，发现可以阻断生物钟基因参与调控的药物成瘾途径，使药物的心理成瘾被克服。38第三节基因治疗常用基因转移的方法一.物理方法电穿透法：借助电流使DNA直接穿过细胞膜转入细胞中。显微注射法：直接将外源基因注射入细胞中，这种方法的操作难度大，失败率较高。基因枪法：微细的金或钨等颗粒，表面吸附DNA，在高压作用下，进入细胞。39二.化学方法：用一定的方法将外源DNA分子包裹成大的沉淀物，然后与靶细胞混合；靶细胞通过内吞作用摄入沉淀物，外源基因就被结合进核内，与染色体整合，外源基因在靶细胞中得以表达。40三.生物学方法常用的病毒载体逆转录病毒(RNA)DNA病毒41病毒介导基因转移（Viralmediatedtransfer）•是通过病毒为载体（vector），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞感染细胞重组病毒421．逆转录病毒（retrovirus）载体•能稳定地将DNA插到宿主基因组的随机位点上。•能高效地感染宿主细胞，感染率可达100%。•逆转录病毒可以侵染不同的细胞类型。•整合的病毒在宿主基因组中比较稳定。•逆转录病毒包装的外源DNA序列可以达到10kb。•逆转录病毒作为基因治疗载体的缺点是：整合在宿主的染色体上，有潜在的致癌性。432．腺病毒载体腺病毒是线状双链DNA病毒。是目前最常用的基因治疗载体之一。它的优点在于：腺病毒比较安全，无致病、致癌、致畸作用。腺病毒的宿主范围较广，能感染多种细胞，因此可用于多种细胞的基因治疗。腺病毒可以在呼吸道和肠道中繁殖，因而不仅44可以通过静脉注射的方式进行基因治疗，还可以通过口服、喷雾、气管内滴注等简单易行的方法进行基因治疗。腺病毒可插入的外源基因可达7.5kb。人们对腺病毒的基因组构造非常了解，以它作为基因治疗的载体比较容易控制。45腺病毒作为基因载体也存在某些缺点：①重组的病毒DNA是以游离的形式存在于细胞中，因而基因表达的时间较短，不能满足基因长期表达的需要；如需进行长期表达，必须反复注射，这无疑会加重患者的痛苦和经济负担。②重组腺病毒载体的反复使用，有可能会诱发机体的免疫反应，从而影响外源基因的表达，并进而影响治疗效果。463．单纯疱疹病毒（HSV）载体单纯疱疹病毒（HSV）属于双链DNA病毒。作为基因治疗的载体有以下特点：•单纯疱疹病毒可容纳高达50kb的外源基因。•单纯疱疹病毒的宿主范围广泛，可以侵染脊椎动物的各种细胞。47•单纯疱疹病毒具有嗜神经性，可以用于一些神经系统疾病的基因治疗，如帕金森氏综合症、老年痴呆症等神经系统疾病的基因治疗。•单纯疱疹病毒载体是目前唯一可以将外源基因导入神经系统的载体。•缺点：单纯疱疹病毒的某些蛋白对宿主细胞有毒害作用。484.腺相关病毒载体•是单链线状DNA载体。•目前认为是不会引起人类疾病的病毒。•宿主范围广，可感染分裂或非分裂细胞。•可整合到宿主细胞的染色体上，且位置相对固定，减少插入突变的可能性。•缺点：容量小，不能超过5Kb。包装效率低。495.嵌合病毒载体用基因重组技术把两种或两种以上的病毒载体序列组合，取长补短505、反义核酸基因治疗反义技术：是指利用人工合成的反义RNA或DNA导入靶细胞，阻断Gene的转录或复制，控制细胞的中间阶段使编码蛋白的Gene不能转录为mRNA或阻断翻译相应蛋白.51反义基因治疗DNADNARNARNA反义RNA阻断表达52有研究表明,一项试验性治疗黄斑病变的方法(即运用小RNA干扰技术来延缓中心区黄斑病变程度)可能引发一些病人失明,这种退行性病变主要发生于50岁以上的人群.某公司的临床研究曾经掩盖了人们对小RNA治疗弊大于利的担忧.加利福尼亚大学的研究人员指出:“会不会治疗一种病变的同时,诱发另一种病变.”53体内本身的小RNA可以通过关闭或沉默某些基因的表达来调节细胞功能。来自迈阿密的OPKOHealth和加州欧文的Allergan两家公司的研发人员检测了小RNA的确可以减轻黄斑病变区的炎症;他们通过将小RNA注入病变区来抑制血管内皮生长因子(VEGF)的表达,进而抑制炎症加重.54张康的研究小组比较了600例视网膜萎缩和非萎缩病人之间TLR3的差异.发现TLR3某些突变可以保护病人免受进一步的炎症性萎缩。携带保护型突变TLR3的病人比正常基因型的病人罹患视网膜萎缩的危险低得多,程度取决于携带突变的比例.而相比之下,携带非保护型突变的病人则更容易被小RNA诱发出萎缩。55这些实验结果进一步提升了对实例研究的关注.科学家担心,“这种小RNA注射可能直接激活TLR3,尤其对于非突变型病例负效应会更明显,也就是说我们非但不能治疗病变,反而引发了另外一些形式的异常”.56第四节基因治疗的靶细胞基因治疗的靶细胞可分为两大类：体细胞和生殖细胞。将遗传物质引入人的体细胞进行基因治疗的方法为体细胞基因疗法（somaticcellgenetherapy）；以生殖细胞为对象的基因治疗称为生殖细胞基因疗法（germcellgenetherapy）。57进行生殖细胞基因治疗能使生殖细胞中的缺陷基因得到校正，使遗传疾病不但能在当代得到治疗，而且还能将校正的基因传给下一代，最终根治遗传疾病。58常用的靶细胞•造血干细胞•成纤维细胞•肝细胞•肌细胞•淋巴细胞591.造血干细胞优点①对骨髓造血干细胞的了解、应用较多②骨髓造血干细胞具有分裂、分化成各种血细胞的潜能③基因产物在骨髓细胞成熟后，可以通过血液循环遍布全身缺点骨髓造血干细胞数量少，仅占0.1％。60应用举例1.人β－珠蛋白基因转入小鼠骨髓干细胞，再输入小鼠体内，可在骨髓、脾脏和血液检测到人β－珠蛋白。2.将腺苷脱氨酶（ADA)基因导入小