细菌超广谱β-内酰胺酶与耐药性

细菌ESBL酶与耐药性主讲人：华耀细菌超广谱β－内酰胺酶与耐药性1、什么是β－内酰胺类抗生素？2、什么是β－内酰胺酶？3、什么是超广谱β－内酰胺酶？4、它们与细菌耐药有什么关系？一、β－内酰胺类抗生素青霉素发现者、英国科学家弗莱明（1928）（一）概念β-内酰胺类抗生素（β-lactams）指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素。(二)β－内酰胺类抗生素抑制细菌的机理N-乙酰葡萄糖胺双糖十肽转肽酶N-乙酰胞壁酸五肽聚合物（PBPs）粘肽（构成细胞壁）β－内酰胺类抗生素（－）胞浆内细胞膜细胞膜外细胞壁合成受阻，细胞壁缺损，外环境水分渗入到菌体，菌体膨胀裂解而死。二、β－内酰胺酶（一）概念β-内酰胺酶（β-lactamase）是细菌产生的可水解β-内酰胺类抗生素的酶。绝大多数常见的β-内酰胺酶有一个依赖丝氨酸发挥作用的机制。通常它们的活性位点具有一个狭窄的纵形沟状结构，在沟的底部形成了一个空腔（氧阴离子袋），这种疏松的构造容易弯曲，便于结合底物。（二）、β-内酰胺酶是细菌耐药的机理丝氨酸的结构式β-内酰胺环上的羰基碳在结合β内酰胺酶活性部位的丝氨酸时发生了不可逆的反应，结果使其成为开环物。（三）β-内酰胺酶分类方法一、Bush-M-J分类法（功能分类法）根据β-内酰胺酶的功能相似性（底物和抑制物的轮廓）分为1，2，3，4四组，其中2组和3组又分为很多亚组。二、Ambler分类法（分子分类法）根据酶的氨基酸序列的保守性和相似性将β-内酰胺酶分为A，B，C，D四组。克拉维酸三、超广谱β-内酰胺酶（一）概念超广谱β-内酰胺酶(extendedspectrumbeta-lactamases,ESBLs)是由质粒介导的能赋予细菌对多种β-内酰胺类抗生素和单酰胺环类抗生素耐药并可被β-内酰胺酶抑制剂所抑制的一类β-内酰胺酶.(二)超广谱β-内酰胺酶特点（1）主要是有质粒介导ESBLs基因由质粒介导,可通过接合、转化和转导等形式在细菌间扩散。（2）产超广谱β-内酰胺酶主要是革兰氏阴性菌如：大肠埃希菌属、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌（3）能被β-内酰胺酶抑制剂所抑制如：CA（克拉维酸）、甲氧西林（1）TEM型ESBLsTEM型ESBLs由TEM-1衍化而来。在TEM家族中TEM-3是第一个显示ESBLs特点的TEM型β-内酰胺酶。TEM型ESBLs的形成是因为238位甘氨酸突变为丝氨酸所形成的。这种突变提高了对头孢噻肟的水解能力。2005年发现的TEM-94发生了104,238氨基酸位点的改变,药敏实验证实其对头孢泊肟和头孢噻肟耐药。（三）超广谱内酰胺酶类型目前发现的超广谱β-内酰胺酶种类已超过200多种,其类型可以分为TEM型、SHV型、OXA型、CTX-M型、其它型等5类。其中TEM和SHV型酶是临床上较常见的超广谱β-内酰胺酶。（2）SHV型ESBLsSHV型ESBLs是由SHV-1衍化而来。SHV家族中第一个SHV型ESBLs是SHV-2。SHV-2发生了Gly-238-Ser位点的突变,这增加了对氧亚氨基类抗生素的亲和力和水解能力。对比其它的SHV型ESBLs氨基酸序列分析发现,氨基酸的突变主要集中在179,238,240,205位点。（三）ESBLs的检测方法1、标准纸片扩散法（1）表型初筛试验按标准纸片扩散法操作，当下述抗菌药物的抑菌环直径头孢泊肟(10µg)≤17mm或头孢他啶(30µg)≤22mm或氨曲南(30µg)≤27mm或头孢噻肟(30µg)≤27mm或头孢曲松(30µg)≤25mm时，提示为可疑产ESBLs菌株。（2）表型确证试验使用头孢他啶(30µg)和头孢他啶/克拉维酸(30/10µg)及头孢噻肟(30µg)和头孢噻肟/克拉维酸(30/10µg)两对药敏纸片，当两个药物中有任何一个在加克拉维酸后抑菌环直径与不加克拉维酸的抑菌环相比增大值≥5mm，可确认为产ESBLs菌株。头孢他啶\克拉维酸头孢噻肟头孢他啶头孢噻肟\克拉维酸2三相水解试验•区分菌株为产ESBLs或产头孢菌素酶（AmpC酶）•ESBLs和AmpC酶同时产生的情况。①号槽：酶粗提物；②号槽：酶+CA；③号槽：酶+氯唑西林（CLO）；④号槽：酶+CA+CLO单产ESBLs菌株①号槽：酶粗提物；②号槽：酶+CA；③号槽：酶+氯唑西林（CLO）；④号槽：酶+CA+CLO联合产ESBLs和AmpC菌株3、E-test法E-test，为ABBIODISK公司开发的测试ESBLs的试剂条。应用表型确证试验的原理，将头孢他啶（或头孢噻肟）和复方制剂头孢他啶/克拉维酸（或头孢噻肟/克拉维酸）分别置于试条两端，将试条贴于接种了待测细菌的平板上，刻度面朝上，35℃培养18-24小时后，读取试条两端的MIC值。当头孢他啶与头孢他啶/克拉维酸（或头孢噻肟与头孢噻肟/克拉维酸）的比值≥8时，即可判定为产ESBLs，否则为阴性。4、分子生物学检测聚合酶链式反应(PCR)参照GenBank已发表的TEM、SHV、CTX-M和OXA各亚型的基因序列，分别设计特异性引物5、总结ESBLs的检测方法表型初筛试验初步判断表型确证试验最终确认三相水解试验确认菌株是否只产ESBLsE-test法分子生物学检测（四）ESBLs的防治(1)开发能够相对或绝对能够抵抗β－内酰胺酶水解的新型抗菌药物。(2)应用β-内酰胺酶抑制剂(3)规范抗生素的使用（一）β-内酰胺酶抑制剂β-内酰胺酶抑制剂是一种β-内酰胺类药物，可与β-内酰胺酶发生牢固的结合而使酶失活，和其他抗生素联用可增强抗菌活性，减少其用量。（二）β-内酰胺酶抑制剂分类按作用分为三类：（1）可逆性竞争性抑制剂：邻氯西林、双氯西林等（2）不可逆竞争性抑制剂：克拉维酸、舒巴坦等（3）非竞争性抑制剂：甲氧西林等β-内酰胺酶β-内酰胺类抗生素β-内酰胺酶克拉维酸不可逆竞争性抑制药物分解，细菌存活酶失活，药物起作用β-内酰胺酶邻氯西林+邻氯西林可逆性竞争性抑制(三)合理使用抗生素•有报道显示抗生素尤其是第三代头孢菌素的应用与ESBLs的感染流行有关。•敏感菌因抗生素的选择性压力而被大量杀灭后，耐药菌得以大量繁殖而成为优势菌，同时抗生素的选择性压力也加快了细菌突变的速度。•因此合理使用抗生素并采取有效的消毒隔离措施，才是预防ESBLs产生的最好方法。