絮凝性酿酒酵母基因工程菌的构建与发酵

江南大学博士学位论文絮凝性酿酒酵母基因工程菌的构建与发酵姓名：王付转申请学位级别：博士专业：发酵工程指导教师：诸葛健;沈微20080401絮凝性酿酒酵母基因工程菌的构建与发酵作者：王付转学位授予单位：江南大学相似文献(10条)1.期刊论文薛颖敏.江宁.XUEYing-Min.JIANGNing酿酒酵母X330高浓度发酵时耐酒精性能的初步研究-生物工程学报2006,22(3)在完全合成培养基条件下,就渗透压保护剂和营养物质对一株产高浓度酒精的酿酒酵母X330高浓度发酵时耐酒精性能的影响进行了初步研究.结果表明,与渗透压相比,营养缺乏对酿酒酵母高浓度发酵时酒精耐受性能可能起着更为关键和重要的作用.发酵培养基中各营养元素对耐酒精性能的影响不同,由高到低的顺序是酵母抽提物＞蛋白胨＞硫酸镁＞维生素C=磷酸二氢钾＞氯化钙=硫酸铵.渗透压保护剂(甘氨酸和脯氨酸)能有效提高菌体酒精耐受性能.当甘氨酸添加浓度为20mmol/L或脯氨酸添加浓度为10mmol/L时,发酵终点酒精浓度最高,菌体于30℃在18%(V/V)酒精冲击下的存活率最大,且均高于对照组(未添加甘氨酸且未添加脯氨酸)水平,但甘氨酸的促进作用强于脯氨酸.2.期刊论文李代昆.张德纯酿酒酵母发酵糖类生产酒精的研究现状-中国微生态学杂志2005,17(2)可再生资源如粮食或植物纤维发酵生产的酒精作为生物能源来代替或部分代替汽油,可以缓解石油日益枯竭的压力,同时具有绿色环保的社会效益.酿酒酵母(S.cerevisiae)是传统的酒精生产菌株,具备良好的工业生产性状,耗糖快、乙醇耐受力高、对水解糖液中有毒物质抗性强;全序列已测定,遗传操作技术也已经成熟.木质纤维素类物质是地球上最主要的可再生资源,木糖是半纤维素的主要组成部分,在植物纤维材料水解液中占30%左右,是继葡萄糖之后自然界中最丰富的糖分.目前,国内外均以淀粉为主要原料生产酒精,酿酒酵母缺乏分解淀粉所必需的淀粉酶,在发酵过程中淀粉需经蒸煮、α-淀粉酶液化处理和随后的酸解或酶解(糖化酶)糖化过程变成葡萄糖后才能被酵母利用,底物的处理成本占很大比例.酿酒酵母发酵糖类生产酒精是一个系统工程,生产流程长,生产工艺复杂,任何环节都可影响酒精生产和酒精产量.现将其研究现状综述如下.3.学位论文洪剑辉应用于纤维素同步糖化发酵（SSF）产酒精的重组酿酒酵母的构建2006纤维素酶可以与酿酒酵母结合来降解纤维素产酒精，其中β-葡萄糖苷酶可以水解纤维二糖生成葡萄糖，而酿酒酵母进而发酵葡萄糖产酒精，这使得纤维素成为酒精生产的一种稳定且可再生的原料，而同时糖化和发酵(SSF)过程被认为是纤维素酒精转化最有效的途径。纤维素酶是这个过程中非常关键的一个因素，高效低价的纤维素酶的获得是使这一过程得到有效利用的关键。然而β-葡萄糖苷酶在纤维素酶系中含量较低，使得纤维二糖成为了这个酶系的主要产物，而纤维二糖是纤维素酶的非竞争性抑制物。因此在酿酒酵母中引入纤维二糖代谢途径、提高β-葡萄糖苷酶的酶活就成了我们研究的重点。根据文献报道的扣囊复膜孢酵母和里氏木霉的β-葡萄糖苷酶编码序列设计引物，采用常规PCR方法和外显子拼接的方法分别得到了它们β-葡萄糖苷酶基因的全编码序列。然后分别与穿梭表达载体pYX212连接，并与其TPI启动子融合，成功构建了酵母表达质粒pYX-sfbgl和pYX-tbgl。通过电转化方法成功将pYX-sfbgl和pYX-tbgl转化入酿酒酵母S.cerevisiaeW303-1A中并获得了成功表达，酶活达到0.504(IU/mL破碎液)和0.124(IU/mL破碎液)。为了实现高拷贝整合，选择在酿酒酵母染色体中具有100～200个拷贝的核糖体RNA的基因rDNA作为整合位点。以穿梭表达载体pYX212为骨架，将酿酒酵母来源的一段rDNA序列替代表达载体上的2μ序列，赋予载体rDNA整合位点的同时使原载体失去自主复制的能力，然后经过对载体的适当修饰和改造，最终形成了rDNA整合载体pYX-MIRY。通过酶活力及酶学性质的分析，由于扣囊复膜孢酵母来源的重组β-葡萄糖苷酶较适合SSF过程，因此将其作为后续实验的研究对象。将其编码基因bgl1与上述构建完成的rDNA整合载体pYX-MIRY连接，然后与带卡那抗性的质粒pSKsymΩKm共转化酿酒酵母，通过筛选得到一株整合重组酿酒酵母S.cerevisiaerRBGL。并将其应用于微晶纤维素的同时糖化和发酵过程中，与宿主进行了比较，结果表明当赋予酿酒酵母纤维二糖分解能力时，能部分解除纤维二糖对纤维素酶的反馈抑制作用，弥补纤维素酶系的低纤维二糖酶活，发酵液酒精度得到了一定的提高。4.期刊论文沈煜.王颖.鲍晓明.曲音波酿酒酵母木糖发酵酒精途径工程的研究进展-生物工程学报2003,19(5)途径工程(Pathwayengineering),被称为第三代基因工程,改变代谢流向,开辟新的代谢途径是途径工程的主要目的.利用途径工程理念,对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)代谢途径进行理性设计,以拓展这一传统酒精生产菌的底物范围,使其充分利用可再生纤维质水解物中的各种糖分,是酿酒酵母酒精途径工程的研究热点之一.这里介绍了近年来酿酒酵母以木糖为底物的酒精途径工程的研究进展.5.期刊论文杨建刚.马跃.肖冬光.星野力.YANGJian-gang.MAYue.XIAODong-guang.XINGYe-li酿酒酵母酒精耐性研究进展-酿酒科技2006,(11)酿酒酵母是目前使用最广泛的菌种之一,它的耐酒精性能及其机理一直被广泛地关注及研究.本文介绍了目前国内外对酵母酒精耐性的研究方向和进展,主要内容包括耐酒精性能评价,以及酵母细胞膜、蛋白质、海藻糖和培养基组成等方面与酒精耐性的关系.6.学位论文薛颖敏高浓度酒精发酵菌株的筛选及应用研究2006本研究通过菌株筛选，得到一株产高浓度酒精的酿酒酵母X330，研究不同的培养条件对其发酵酒精能力的影响，为工业化应用提供理论和实践上的指导。研究结论如下：(1)以酿酒酵母X330为材料，研究各种因子(糖浓度、氮源、无机盐、pH值、温度、接种量)对其发酵酒精能力的影响。结果表明，各种氮源对发酵酒精能力的影响不同，由高到低的顺序是酵母膏蛋白胨硫酸铵尿素氯化铵。初步找到了发酵250g/L葡萄糖，菌株所需三种主要无机盐的临界值，分别是磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁3g/L，氯化钙1.5g/L。最佳初始pH值为5.0；最佳发酵温度为30℃；最佳接种量为10％(v/v)。(2)就添加营养物质、渗透压保护剂和肌醇对酿酒酵母X330高浓度发酵时生产酒精能力的影响进行了初步研究。结果表明，与渗透压相比，营养缺乏对酿酒酵母高浓度发酵时酒精产量可能起着更为关键和重要的作用。发酵培养基中各营养元素对酒精发酵的影响不同，由高到低的顺序是酵母抽提物蛋白胨硫酸镁维生素C=磷酸二氢钾氯化钙=硫酸铵。渗透压保护剂(甘氨酸和脯氨酸)能有效提高菌体发酵酒精能力。当甘氨酸添加浓度为20mmol/L或脯氨酸添加浓度为10mmol/L时，发酵终点酒精浓度最高，但甘氨酸的促进作用强于脯氨酸。肌醇可以提高发酵速度和菌体的发酵能力。本研究通过菌株筛选，得到一株产高浓度酒精的酿酒酵母X330，研究不同的培养条件对其发酵酒精能力的影响，为工业化应用提供理论和实践上的指导。研究结论如下：(1)以酿酒酵母X330为材料，研究各种因子(糖浓度、氮源、无机盐、pH值、温度、接种量)对其发酵酒精能力的影响。结果表明，各种氮源对发酵酒精能力的影响不同，由高到低的顺序是酵母膏蛋白胨硫酸铵尿素氯化铵。初步找到了发酵250g/L葡萄糖，菌株所需三种主要无机盐的临界值，分别是磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁3g/L，氯化钙1.5g/L。最佳初始pH值为5.0；最佳发酵温度为30℃；最佳接种量为10％(v/v)。(2)就添加营养物质、渗透压保护剂和肌醇对酿酒酵母X330高浓度发酵时生产酒精能力的影响进行了初步研究。结果表明，与渗透压相比，营养缺乏对酿酒酵母高浓度发酵时酒精产量可能起着更为关键和重要的作用。发酵培养基中各营养元素对酒精发酵的影响不同，由高到低的顺序是酵母抽提物蛋白胨硫酸镁维生素C=磷酸二氢钾氯化钙=硫酸铵。渗透压保护剂(甘氨酸和脯氨酸)能有效提高菌体发酵酒精能力。当甘氨酸添加浓度为20mmol/L或脯氨酸添加浓度为10mmol/L时，发酵终点酒精浓度最高，但甘氨酸的促进作用强于脯氨酸。肌醇可以提高发酵速度和菌体的发酵能力。7.期刊论文王浩月.葛向阳.钱和.WANGHao-Yue.GEXiang-Yang.QIANHe利用米曲霉和酿酒酵母高效转化大豆糖浆为酒精-生物技术2008,18(2)目的:提高大豆糖浆转化为酒精的生产强度和转化率.方法:利用米曲霉L-09和酿酒酵母Z-06作为混合菌株,采用同步糖化与发酵的工艺,对补料方式和发酵条件进行优化.结果:筛选出一株α-半乳糖苷酶酶活(12.8IU,mL)较高的米曲霉与酿酒酵母混合发酵,糖浆最佳发酵条件为:初始发酵浓度50%,摇瓶发酵,流加补料.结论:经30℃、60h发酵后,发酵醪酒精浓度达到15.2%(V/V),转化率为理论值的96.3%.8.学位论文杨智酿酒酵母ST-01的发酵特性与SCAR标记研究2007本研究以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)为研究对象，先进行常规啤酒发酵试验，通过测定其发酵过程中的各项指标筛选到一株发酵性能优良的菌株ST-01，再通过筛选RAPD标记转化为SCAR分子标记。克服了RAPD标记的不稳定缺点，同时保留了RAPD标记的随机扩增多态性丰富、标记快速的优点，为探索酿酒酵母快速准确标记提供了方法和数据，同时也为生产企业保护其专利菌株提供了一个快捷、准确的方法。以发酵性能具有代表性的不同来源的共8株酿酒酵母进行啤酒发酵试验，比较了不同菌株在发酵过程中的各项指标。试验结果显示：发酵试验重复性较好，各项指标一致，其中ST-01菌株在啤酒发酵中具有凝聚性适中，产气能力强的感官优势；在发酵第8天出现双乙酰的峰值，其峰值为0.55mg/L，后又以较快的速度发生双乙酰的还原，发酵结束时双乙酰的含量下降到0.05mg/L左右，表明啤酒快速成熟；酒精含量高达4.536g/100ml；发酵结束后发酵度达到了64.74％。而其他7株酿酒酵母的降糖能力远远小于ST-01菌株。相应的双乙酰和酒精含量的变化也显示这7株酵母的发酵性能低于ST-01菌株，预示ST-01是一株优秀的啤酒酿造菌种。将菌株ST-01和本实验室保藏的其他22株酿酒酵母菌株分别进行分子比较，寻找ST-01基因组特征序列作为分子标记。试用50条随机引物对23株酿酒酵母基因组DNA进行RAPD扩增，优化后的RAPD扩增体系为：模板DNA为120ng，2.5mMMg'2+，Taa酶1U，200μMdNTPs，10pmol随机引物，反应总体积为25μL；PCR热循环参数为93℃2min，36℃1min，72℃2min1次循环；93℃1min，36℃1min72℃2min，40次循环；93℃1min，36℃1min，72℃10min1次循环，筛选到P09和P46两条随机引物对ST-01菌株具有较好的特异性。P09可以从2.412，ST-01，SK-26，ZD-01四株酿酒酵母基因组DNA中稳定扩增出长度为433bp的SCAR-Sc433片断；P46可以从2.1882，ST-01，NJ-02三株酿酒酵母基因组DNA中稳定扩增出长度为665bp的SCAR-Sc665片断。供试菌株中仅有ST-01能稳定的具有这两个扩增片段。对这两个片断进行回收后连接到pUCmT质粒载体，导入大肠杆菌DH-5α中，筛选阳性克隆，酶切鉴定后的质粒经过测序根据序列设计了2对特异性引物，建立了PCR方法检测SCAR-Sc433和SCAR-Sc665片段，结果表明ST-01可以特异性的扩增出这两个DNA片段，显示了ST-01与其他菌株的分子差别。本研究将SCAR-Sc433和SCAR-Sc665特