第三章 灭菌与除菌工艺与设备

第三章灭菌与除菌工艺及设备SterilizationDegerming在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果：1.生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；2.在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主；3.杂菌及其产生的物质，使提取精制困难；4.杂菌会降解目的产物；5.杂菌会污染最终产品；6.发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象。灭菌或除菌的目的第一节发酵生产在有害微生物的控制•将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以接受的总数N(10-3)，需要多高的温度、多长的时间为合理。•灭菌温度和时间的确定取决于：•杂菌孢子的热灭死动力学•反应器的形式和操作方式•尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：•培养基中不同营养成分间的相互作用；•对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解一、培养基灭菌需解决的工程问题(无菌概念)二、控制有害微生物的主要方法控制有害菌抑制杀灭抑制宿主体内的病原菌化疗抑制霉腐微生物防腐部分杀灭消毒彻底杀灭灭菌溶菌杀菌灭菌方法•化学物质灭菌•辐射灭菌•干热灭菌•火焰灭菌•湿热灭菌•过滤除菌灭菌(Sterilization)：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物(营养体及其孢子)永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指菌体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后，其细胞发生溶化、消失的现象。（一）热灭菌的原理•高温致死原理：由于它使微生物的蛋白质和核酸等重要生物高分子发生变性、破坏，例如它可使核酸发生脱氨、脱嘌呤或降解，以及破坏细胞膜上的类脂质成分等。•湿热灭菌要比干热灭菌更有效，一方面是由于湿热易于传递热量，另一方面是由于湿热更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，从而加速其变性。热灭菌方法：（1）常压法间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法（2）加压法pasteurization杀死微生物的极限温度称为致死温度(lethaltemperature)。在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。一、湿热灭菌(Moistheatsterilization)的原理10t(min)N/N0大肠杆菌在不同温度下的死亡曲线10-110-210-310-424681060585654第二节培养基灭菌各种微生物对湿热的相对热阻微生物相对热阻营养细胞和酵母1.0细菌芽孢3×106霉菌孢子2~10病毒和噬菌体1~5微生物的热阻：是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。（一）微生物的热阻1.对数残留定律实验证明，微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：t：灭菌时间sk：比死亡速率s-1，dNt/dt代表？(菌的瞬时变化速率)N0：开始灭菌时原有菌体数Nt：残留菌体数，cfu/mlttkttNNkNNktNkNe000t0ttlg303.2ln13N2ktNNln1dtdN-或（二）灭菌动力学-----对数残留定律10t(min)N/N010-110-210-310-42468106058565410t(min)N/N0大肠杆菌在不同温度下的死亡曲线10-110-210-310-424681060585654嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线10t(min)N/N010-110-210-310-4510152025121116110108105•实验证明，细菌孢子的热杀灭动力学与营养细胞的有所不同。它表现为非对数的死亡动力学。这可能与孢子壁的化学成分及结构有关。但当温度超过120˚C时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接近对数死亡动力学即符合一级反应规律。2.非对数死亡规律在一定温度下，比死亡速率k随微生物种类不同而不同。营养细胞VS芽孢(spore,endospore)同一种微生物来说，比死亡速率k值随着温度的变化而变化。营养细胞的热死表现出典型的对数死亡速率（三）灭菌的温度和时间ktteNN0tNNkt0ln1同一种微生物来说，比死亡速率k值随着温度的变化而变化。即一级反应4RTEAekA：系数∆E：活化能•活化能ΔE的大小对k值有重大影响。其它条件相同时，ΔE越高，k越低，热死速率越慢。•不同菌的孢子的热死灭反应ΔE可能各不相同。阿仑尼乌斯定律ArrheniuslawAkRTElnln（5）1/Tk（min-1）对（4）两边取对数，得（5）•k是ΔE和T的函数，k对T的变化率与有关，对（5）两边对T的导数，得（6）由（6）可得出结论：反应的ΔE越高，lnk对T的变化率越大，即：2lnTREdTkd（6）T的变化对k的影响很大lnk1t36.29T3415.9lnk0tNN培养基中存在各种各样的微生物，它们的k各不相同。取对热抵抗力较大的芽孢杆菌的k进行计算。此时：A=1.34×1036∆E=2.84×1054RTEAek大部分培养基的破坏可认为是一级反应RTEAekckdtdc`''培养基成分的破坏21TT11RTEAek22RTEAek211211lnTTREkk培养基温度微生物死亡比速211211lnTTREkk''1'212lnlnEEkkkk21''1'211lnTTREkk培养基成分的破坏两式相除微生物死亡比速受热物质ΔE（J/mol）维生素B1296300维生素B1盐酸盐108860嗜热脂肪芽孢杆菌孢子283460肉毒梭菌孢子346260枯草杆菌孢子3182100lnln'1'212kkkk6.396300346260lnln''1'212EEkkkk'1'212kkkk21TT嗜热脂肪芽孢杆菌孢子和维生素B12的lnk-1/T图•将灭菌温度从105˚C提高到127˚C，KVB从0.02(min-1)提高到0.06(min-1)KBS从0.12(min-1)提高到40.0(min-1)•将温度提高到一定程度，会加速细菌孢子的死灭速度，缩短灭菌时间，由于有效成分的ΔE很低，温度的提高只能稍微增大其破坏速度，但由于灭菌时间的显著缩短，有效成分的破坏反而减少。嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死灭程度为N/N0=10-16时，灭菌温度对维生素B12破坏的影响灭菌温度（˚C）达到灭菌程度的时间（min）维生素B12的损失（%）10084399.9911075891207.6271300.851101400.10731500.0151分批灭菌设备示意图（一）分批灭菌(batchsterilization)二、培养基的分批灭菌1.预热（前期）2.预热（后期）3.保温阶段4.冷却阶段•在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个过程（一）分批灭菌(batchsterilization)1)升温阶段前期：ln21TTTThFGctssG、培养基质量；c、比热容；Ts、蒸汽温度；h、传热系数；F、换热面积其中：夹套的传热系数230-350W/m2℃蛇管的传热系数350-520W/m2℃GchFtexp1TTTTsstGchFTTTTTsssexp11整理后温度和时间的关系为：1)升温阶段后期：升温阶段，随着温度升高，比死亡速率常数不断增大，100℃后更为明显，故不能用一级反应动力学计算。若升温结束时菌数为N1，则：tGStTcGSHTTs111dtRTEkdtNNtt0001Aexp-ln212ln1NNkt死亡比速为常数2)保温阶段死亡比速不是常数3)冷却阶段dtRTENNft02Aexpln总灭菌时间：321tttt各阶段的灭菌贡献大致为：20:75:51)升温阶段kgC)(2s12tttGCS加热蒸汽用量和Cs分别为蒸汽的热焓和比热容2）保温阶段F：蒸汽排出口的面积；P：蒸汽压力；V、蒸汽的比体积19.1vPFtS=计算举例参见：《微生物工程工艺原理》姚汝华《生化工程》伦世仪主编三、连续灭菌(continuoussterilization)1、定义：将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌。发酵罐蒸汽蒸汽冷却水无菌培养基配料罐泵加热塔维持罐冷却管连续灭菌的基本设备一般包括（1）配料预热罐，将配制好的料液预热到60-70℃，以避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；（2）连消塔，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混和，并使料液的温度很快升高到灭菌温度（126-132℃）；（3）维持罐，连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的，维持罐的作用是使料液在灭菌温度下保持5-7min，以达到灭菌的目的；（4）冷却管，从维持罐出来的料液要经过冷却排管进行冷却，生产上一般采用冷水喷淋冷却，冷却到40-50℃后，输送到预先已经灭菌过的罐内。3、连续灭菌设备的结构（1）设备结构：套管式连消塔喷嘴式连消塔喷射加热器板式换热器结构(plateexchanger)传热片支架压紧板进出口管件支架，压板上可以开柄槽，开孔，可以接装进出口管件，或改变流体的流向开孔厚板(保温板，中间进液板)多段式的热交换器中，在压紧板与支架板之间，紧固件,有单螺杆；四螺杆等。（2）薄板换热器连续灭菌薄板换热器连续灭菌流程进料35℃100℃120℃维持罐120℃蒸汽147℃120℃55℃出料35℃水20℃31℃流程中采用了薄板换热器作为培养液的加热和冷却器，蒸汽在薄板换热器的加热段使培养液的温度升高，经维持段保温一定时间后，培养基在薄板换热器的冷却段进行冷却，从而使培养基的预热、加热灭菌及冷却过程可在同一设备内完成。该流程的加热和冷却时间比喷射加热连续灭菌流程要长些，但由于在培养基的预热过程同时也起到了灭菌后培养基的冷却，因而节约了蒸汽和冷却水的用量。喷淋冷却维持罐连续灭菌与分批灭菌的比较与选择分批灭菌优点：1．不需附加设备2．蒸汽利用率高3．节约劳动力缺点1．培养基质量比较差2．罐的利用率低3.冷却水用量大连续灭菌优点：1采用高温快速灭菌法2．可以把培养基按其性质分开灭菌3．有利于自动控制4．节省冷却水缺点1．投资费用高2．对物料要求高3．蒸汽用量大选择原则：1．培养基成份（易降解成分、液化情况等）2．设备状况（冷却面积、传动装置等）3.动力条件发酵罐空消之后不能立即冷却，先用无菌空气保压，待灭菌的培养基输入罐内后，才可以开冷却系统进行冷却。分空气过滤器在发酵罐灭菌之前进行灭菌，灭菌后用空气吹干备用。补料罐的灭菌温度视物料性质而定，如糖水，灭菌时蒸汽压力为0.1MPa(121℃)，保温30分钟。油罐(消沫剂罐)灭菌时，其蒸汽压力为0.15-0.18MPa，保温60分钟。补料管路、消沫剂管路可与补料罐、消沫剂罐同时举行灭菌，保温时间为1小时。移种管路灭菌一般要求蒸汽压力为0.3～0.45MPa，保温1小时。发酵设备的灭菌补料液的灭菌在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这些料液都必需经过灭菌。灭菌的方法则视料液的性质、体积和补料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭菌较为合适。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属设备和管道都要经过灭菌。第三节空气灭菌制备•发酵工业应用的“无菌空气”是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。无菌空气(Asepticair)的概念•空气中的微生物种类以细菌和细菌芽胞较