肿瘤自杀基因治疗及中药方药的增效作用和机制

肿瘤自杀基因治疗及中药方药的增效作用和机制主讲人：杜标炎广州中医药大学课题资助情况国家自然科学基金（编号：30171201;30572433;30672747）广东省科技攻关计划（编号：2005B3030102）广州市科委（编号：2002J1-C7401）广东省中医药管理局（编号：A401028；1050079）广州中医药大学(K0050031)内容•研究背景及研究思路•HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建•中药方药对肿瘤自杀基因治疗的增效作用•中药方药增效作用的机制•肿瘤自杀基因治疗系统的改进工作研究背景及研究思路基因治疗的概念基因治疗就是将外源性基因导入到正常或病变细胞中，利用其转录或翻译产物发挥治疗作用的一种方法基因治疗的策略基因治疗的临床试验肿瘤的基因治疗恶性肿瘤由于患者来源广，用于治疗的基因多，容易复制动物模型等原因而成为首选对象目前常用的肿瘤基因治疗方案•肿瘤的免疫基因治疗•肿瘤抑制基因治疗•自杀基因治疗（最有应用前景）•肿瘤多药耐药性基因治疗•抑制血管生成的基因治疗自杀基因的概念所谓自杀基因是指在一定条件下，可以引起细胞自动死亡的基因目前研究的多数自杀基因是通过编码病毒或细菌的酶介导敏感性，这些酶能把药物的无活性形式转化为毒性代谢产物，引起细胞死亡基因名称底物产物旁杀伤效应备注单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）GCV，ACV，PCV，BCV，BVDU，BVDC，IVDU等核苷类似物磷酸化的核苷类似物有研究最多已上临床水痘带状疱疹病毒胸苷激酶（VZV-tk）araMaraATP－大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（EC-CD）5-FC5-FU有已上临床大肠杆菌硝基还原酶（NTR）CB1954，MTZ，NFT羟胺衍生物有研究正在兴起大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（EC-XGPRT或gpt基因）6TG6TX6-硫代鸟嘌呤酸有细胞色素P450CYP2B1CPA，IFA碱性化的底物有细胞羧肽酶G2（CPG2）CMDA芥类药物有大肠杆菌DeoD基因（PNP）Mep-dr6-甲嘌呤有白细胞介素1β转化酶（ICE）RARP，LaminsRb，U1-70kD等被降解失活的底物－p53－－有目前应用于实验室和临床主要的自杀基因治疗系统自杀基因治疗的优势①特异性杀伤基因表达细胞②杀伤多药耐药性（MDR）肿瘤细胞③基因的表达只需将一定量的前药转换成足以杀伤肿瘤细胞的剂量即可，而无需基因的长期表达④绝大部分自杀基因存在极明显的“旁杀伤效应”，体外只需有10％以上的肿瘤细胞表达自杀基因，就可以杀伤绝大部分甚至全部肿瘤细胞⑤良好的瘤苗旁杀伤效应旁杀伤效应作用机制“缝隙连接”机制免疫介导机制“细胞凋亡”机制介质机制抗肿瘤血管生成缝隙连接机制免疫介导机制tk+死亡大量抗原释放免疫细胞浸润细胞因子释放免疫炎症系统介导的非特异性杀伤诱发特异性抗肿瘤免疫反应12免疫抑制免疫激活免疫增强旁杀伤效应增强死亡“细胞凋亡”机制自杀基因引起细胞死亡的形式为细胞凋亡tk+细胞凋亡形成凋亡小体为tk-细胞吞噬引起tk-细胞死亡细胞死亡tk-细胞介质扩散CD5-Fc5-Fu5-Fu5-Fu5-FuCD-细胞死亡抗肿瘤血管生成注：自杀基因单纯自杀基因治疗存在主要问题目的基因转染率低而杀伤力不足；缺乏靶向性，自杀基因的表达缺乏组织特异性和时序性等，单纯自杀基因治疗难以完全消除肿瘤细胞肿瘤自杀基因疗法的增效方法双自杀基因治疗联合治疗联合免疫基因治疗联合放射治疗联合化学治疗联合其他基因靶向基因治疗增强旁杀伤效应单纯自杀基因治疗易复发联合治疗增效联合免疫基因联合放化疗多基因间互相干扰，难以保证导入基因表达或长期表达；使用病毒载体量增多，潜在毒副作用增大；操作过程复杂，成本较高联合中药方药载体转染效率低靶向性不够自杀基因疗法联合中药方药可能是一种更为有效和可行的方案研究思路增强免疫功能增强“缝隙连接”功能增强杀伤敏感性提高旁杀伤效应•肯定的免疫药理作用•多靶点作用•给药方便，价格低廉，毒副作用小或无明显毒副作用HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建技术路线获得目的基因酶切酶切鉴定质粒重组病毒包装和阳性克隆筛选病毒感染胃癌细胞重组质粒鉴定病毒滴度测定GCV杀伤试验斑点杂交鉴定目的基因（tk基因）的获得由美国匹兹堡大学药理教研室HuangL.教授惠赠，广州军区总医院赵亚刚博士提供（pICl9R/MCl-tk质粒）pICl9R/MCl-tk质粒酶切鉴定结果12345a：pICl9R/MCl-tk质粒结构图b：pICl9R/MCl-tk质粒的酶切鉴定电泳图谱注（b）：1：Marker(λDNAHindⅢ)；2：pICl9R/MCl-tk质粒3：pICl9R/MCl-tk质粒/BamHⅠ；4：pICl9R/MCl-tk质粒/BamHⅠ+EcoRⅠ5：Marker(λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ)重组质粒的限制性内切酶鉴定结果a：pLXSN-tk质粒结构图b：pLXSN-tk质粒的酶切鉴定电泳图谱1234561．DNAmarkerⅨ(分子量分别为2.5kb,2.0kb,1.5kb,1.0kb,500bp,300bp)2．pLXSN-tk经EcoRI单酶切3．4．pLXSN-tk经EcoRI/BamHI双酶切5．pLXSN-tk质粒6．DNA/EcoRI/HindⅢmarker重组质粒的测序图鉴定结果PT67包装细胞筛选结果a：G418筛选5d后的PT67b：筛选2w后形成的阳性克隆细胞图3pLXSN-tk质粒转染包装细胞PT67结果病毒滴度测定及结果本实验测定滴度最高为1×104cfu/mL胃癌细胞tk基因的斑点杂交鉴定123胃癌细胞SGC-7901、SGC-7901/tk的DNA与tk探针的斑点杂交图注：1.pLXSN/tk质粒DNA（阳性对照）；2.SGC-7901细胞DNA；3.SGC-7901/tk细胞DNAGCV对人胃癌细胞SGC-7901的体外杀伤试验0501001500123时间（天）存活率（%）SGC-7901SGC-7901/tk结论及意义已成功已成功构建了逆转录病毒载体介导的HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统成功的构建，为后续的研究工作奠定了坚实的基础中药方药对肿瘤自杀基因治疗的增效作用动物水平实验•技术路线H22/tk＋和H22/tk－按1∶4混合接种小鼠皮下组织（2×106细胞）病毒感染肝癌细胞疗效观察动物分组GCV体外杀伤试验成瘤后治疗小鼠移植性肝细胞癌治疗实验(六味地黄)分组及治疗模型对照组正常对照组联合治疗组六味地黄丸治疗组自杀基因治疗组（造模）第2天第6天第16天蒸馏水灌胃每天0.5mL腹腔注射生理盐水每天0.25mL蒸馏水灌胃每天0.5mL腹腔注射生理盐水每天0.25mL腹腔注射生理盐水每天0.25mL腹腔注射GCV100mg﹒kg-1﹒d-1腹腔注射GCV100mg﹒kg-1﹒d-1六味地黄丸悬液灌胃10g﹒kg-1﹒d-1蒸馏水灌胃每天0.5mL六味地黄丸悬液灌胃10g﹒kg-1﹒d-1（造模）（造模）（造模）（生理盐水）肿瘤生长体积曲线02004006008001000120014001600180068101214体积（mm3）模型对照组六味地黄治疗组自杀基因治疗组联合治疗组时间（d）肿瘤质量及抑瘤率组别n肿瘤质量（g）抑瘤率（%）模型对照组191.5825±1.2380六味地黄治疗组190.8498±0.716346.3自杀基因治疗组200.9904±0.979637.4联合治疗组180.5859±0.3786*63.0注：*与模型对照组比较P0.05抑瘤率=（模型组肿瘤质量－治疗组肿瘤质量）/模型组肿瘤质量×100%肿瘤质量图示瘤重直方图00.511.52模型组六味组GCV组联合组组别瘤重(g)瘤重病理检查结果(肉眼观察)注：第二组：肿瘤模型组；第三组：六味地黄丸治疗组；第四组：自杀基因治疗组；第五组：联合治疗组病理检查结果(光镜观察)模型对照组肿瘤细胞数量较多，密集。六味地黄丸治疗组肿瘤细胞数量较多，密集。自杀基因治疗组肿瘤细胞数量密度相对较少。联合治疗组肿瘤细胞数量密度相对较低。各组细胞密度模型对照组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织六味地黄丸治疗组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织自杀基因治疗组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织联合治疗组：肿瘤组织内肿瘤细胞坏死，呈核固缩表现，并见大片红染无结构的坏死组织。各组肿瘤坏死情况模型对照组：肿瘤周边纤维组织增生不明显，未见明显包膜六味地黄丸治疗组：肿瘤周边纤维组织增生较明显，形成较明显的假包膜自杀基因治疗组：肿瘤周边纤维组织增生较明显，形成较明显的假包膜联合治疗组：肿瘤周边纤维组织增生较明显，形成较厚的假包膜各组肿瘤纤维结缔组织增生情况模型对照组：肿瘤边缘见少量炎细胞浸润六味地黄丸治疗组：肿瘤边缘纤维结缔组织内见较多量炎细胞浸润自杀基因治疗组：肿瘤边缘纤维结缔组织内见较多量炎细胞浸润联合治疗组：肿瘤边缘纤维结缔组织内见大量炎细胞浸润各组肿瘤组织炎细胞浸润情况肝癌治疗实验结论自杀基因疗法与六味地黄丸联合应用于小鼠移植性肝细胞癌的治疗具有协同效应，表明六味地黄丸对自杀基因治疗小鼠移植性肝细胞癌具有增效作用丹参注射液H22肝癌荷瘤小鼠剥落瘤块照片A模型对照组；B丹参组；Ctk/GCV组；D联合组.•技术路线tk＋和tk－细胞按1∶4混合接种小鼠皮下组织（1×106细胞）病毒感染黑色素瘤细胞疗效观察动物分组及治疗GCV体外杀伤试验小鼠移植性黑色素瘤治疗实验分组及治疗模型对照组正常对照组联合治疗组六味地黄丸治疗组自杀基因治疗组（造模）第2天第7天第27天蒸馏水灌胃每天0.5mL腹腔注射生理盐水每天0.25mL蒸馏水灌胃每天0.5mL腹腔注射生理盐水每天0.25mL腹腔注射生理盐水每天0.25mL腹腔注射GCV100mg﹒kg-1﹒d-1腹腔注射GCV100mg﹒kg-1﹒d-1六味地黄丸悬液灌胃10g﹒kg-1﹒d-1蒸馏水灌胃每天0.5mL六味地黄丸悬液灌胃10g﹒kg-1﹒d-1（造模）（造模）（造模）（生理盐水）成瘤时间接种模型对照组六味地黄丸治疗组自杀基因治疗组联合治疗组24681012141618202224262830成瘤率瘤重直方图0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%肿瘤组六味组GCV组联合组组别瘤重(g)成瘤率肿瘤生长体积曲线时间（d）050010001500200025001012131416181920212224肿瘤体积(mm3)模型对照组自杀基因治疗组六味地黄治疗组联合治疗组时间（d）肿瘤质量及抑瘤率注：*与模型对照组比较P0.05六味地黄治疗组因有2只肿瘤较大的荷瘤小鼠后期死亡未能获得肿瘤标本，该数据低于实际数据抑瘤率=（模型组肿瘤质量－治疗组肿瘤质量）/模型组肿瘤质量×100%组别n肿瘤质量（g）抑瘤率（%）模型对照组100.9583±1.3260自杀基因治疗组110.3566±0.856962.8六味地黄治疗组70.4369±0.693754.4联合治疗组100.1234±0.2538*87.1各组肿瘤质量图示瘤重直方图00.20.40.60.811.2模型组六味组GCV组联合组组别瘤重(g)瘤重注：六味地黄治疗组因有2只肿瘤较大的荷瘤小鼠后期死亡未能获得肿瘤标本，该数据低于实际数据病理检查结果(肉眼观察)注：B：肿瘤模型组；C：自杀基因治疗组；D：六味地黄丸治疗组；E：联合治疗组病理检查结果(光镜观察)模型对照组模型对照组：肿瘤组织内可见细胞密集，细胞内可见黑色素自杀基因治疗组肿瘤组织内可见细胞密集细胞内可见黑色素六味地黄治疗组肿瘤组织内可见密集的肿瘤细胞联合治疗组肿瘤组织内可见细胞密度稍降低各组细胞密度模型对照组肿瘤内可见大片坏死组织自杀基因治疗肿瘤内可见大片坏死组织六味地黄治疗组肿瘤内可见大片坏死组织联合治疗组肿瘤内可见坏死组织各组肿