胃癌化疗多药耐药研究进展

胃癌化疗多药耐药研究进展上海交通大学附属第六人民医院消化科陈金联胃癌是我国常见的恶性肿瘤，且中晚期癌(进展期癌)占很大的比例。化疗是其治疗的重要手段之一。由于肿瘤细胞的耐药性，化疗疗效常欠理想。20世纪60年代末，Biedler和Riehm在中国仓鼠肺细胞上成功地筛选出对放线菌素D耐药的细胞株，这种细胞株对结构与作用机制不同的多种药物，如长春新碱、柔红霉素和丝裂霉素等产生耐药性，此种现象称多药耐药性(multidrugresistance,MDR)。MDR包括原发性或继发性耐药。原发性耐药指化疗开始时已经存在，继发性耐药指在化疗过程中产生的耐药性。MDR是导致肿瘤化疗失败的原因之一，目前较为明确的机制包括：①多药耐药基因mdr1及其编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein,Pgp)过度表达；②多药耐药相关蛋白（MDR-relatedprotein,MRP）基因及其家族MRP2~6的过度表达；③肺耐药相关蛋白(lungresistance-relatedprotein,LRP)的过度表达；④谷胱甘肽S转移酶(GST)的活性增加，⑤DNA拓扑异构酶Ⅱ(topoisomeraseⅡ,ToPoⅡ)量和质的改变。Pgp、MRP和LRP同属细胞膜ATP结合蛋白大家族(ATP-bindingcassettesuperfamily)的成员，是导致肿瘤细胞多药耐药的重要原因。目前已发现该基因家族有五十多个成员。一、胃癌的化疗(一)胃癌化疗药物常用药物有5-氟尿嘧啶（5-FU）、丝裂霉素、阿霉素、表阿霉素、顺铂（Cisplatin,CDDP）和卡铂等，其化疗疗效约20%。Paclitaxel（taxol）是从太平洋红豆杉树皮分离出来，阻碍形成微小管的主要蛋白质tubulin而发挥抗癌作用；taxotere系从欧洲红杉叶来源的半合成taxol类似物，已用于胃癌联合化疗中。喜树碱（camptothein,CPT）为中国喜树碱提出的植物生物碱，系拓扑异构酶(topoisomerase)Ⅰ型阻断剂。其衍生物CPT-11在临床Ⅱ期试验中，对进展期胃癌有效率约20%。(二)联合化疗胃癌化疗常用的是5-FU、FT-207、UFT、氟铁龙（furtulon,5’DFUR）等氟尿嘧啶类与丝裂霉素、顺铂、卡铂、阿霉素和表阿霉素（epirubicin,THP）等1~2种药物联合应用。CPT-11与CDDP有协同作用，临床二期试验中，疗程的第1天用CDDP80mg/m2,第1天和第15天用CPT-1170mg/m2,每4周重复，50%存活期为10个月。EAP（Etoposide+Adriamycin+CDDP）是强力化疗，主要适用于身体状况及一般情况较好的病人，因其副作用较大。(三)新辅助化疗胃癌确诊时多数已属晚期，单纯根治术5年生存率仅为40%左右，即使采用扩大根治术亦未能显著提高术后生存率。因为肿瘤存在亚临床转移，即使肿瘤在早期阶段亦可出现亚临床转移，单纯手术切除难以清除微小亚临床转移灶，因而导致术后转移、复发，近年对胃癌患者应用围手术期辅助化疗，包括术前辅助化疗，又称新辅助化疗。胃癌术前辅助化疗，对于不能手术的胃癌有效，而且对手术后有肝转移和淋巴结转移者有作用。它能延长患者的生存期。此外，胃癌术前化疗可使胃癌TNM分期减低的作用，如原有肝转移的第Ⅳ期不能手术的胃癌患者，术前化疗后可能使手术成为可能。常用的药物为5-FU、CDDP、阿霉素、表阿霉素、丝裂霉素、拓扑异物酶抑制剂，CPT-11及VP-16、MTX、Taxol、Taxotere等。一般主张联合应用化疗药物。二、胃癌多药耐药机制(一)ATP结合蛋白与胃癌耐药（1）Pgp、MRP和LRP的基因定位及其蛋白结构Juliano和Ling首先观察到具有MDR表型的中国仓鼠细胞株的细胞膜上，相对分子质量为170KD的糖蛋白过度表达，此糖蛋白能调节细胞渗透性，取名为P-糖蛋白（Pgp）。人Pgp家族由mdr基因家族编码，又分为PgpⅠ(Pgp)与PgpⅢ，分别由mdr1和mdr3基因编码。一般Pgp过度表达与MDR有关。人类mdr1基因由4500个碱基对组成，位于7号染色体q21上，其mRNA为4.1kb。Pgp是由1280个氨基酸构成，并组成2个同源部分，每一部分包含6个跨膜功能区和1个ATP结合点。跨膜功能区具有疏水性，ATP结合点则为药物的泵出提供能量。如果2个ATP结合点的任何一个失活，则导致细胞的MDR功能丧失。Pgp和己知的许多转运蛋白，如溶血素B、白细胞毒素等的结构和功能相似。抗癌药物通过被动扩散到细胞内，然后与细胞膜糖白结合依靠ATP水解供能而主动泵出细胞外，从而导致肿瘤细胞多种耐药性。1992年，Cole等在两种非PgpMDR细胞株上首先发现一种膜转运蛋白基因过度表达并命名为mrp，其编码蛋白质为MRP，基因定位于16p13.1。mrp与mdr1基因有14%的同源序列。mrpmRNA全长6.5kb，编码1531个氨基酸组成的分子量为190KD的蛋白质。MRP结构与Pgp相似。MRP和Pgp有19%同源性。MRP碳末端核酸结合位点上末位12个氨基酸为特征性标志，MRP和Pgp在第5、8两个氨甚酸位点上不一致。MRP家族其他5个成员，分别命名为MRP2、MRP3、MRP4、MRP5和MRP6。MRP6与MRP基因均定位于染色体16P13,外显子均为31个。编码MRP3～5的基因与MRP基因不在同一染色体上。MRP基因家族分为两组，一组包括MRP1、MRP2、MRP3和MRP6，氨基酸序列同源性45%～48%，特征为氮末端延伸200个氨基酸与5个胯膜片段结合；另一组包括MRP4和MRP5，与MRP1同源性34%～39%，与Pgp相似，氮来源无上述延伸结构。1993年Scheper等在肺癌细胞株上发现相对分子质量为110000的蛋白(LRP)过度表达，并认为是导致该细胞MDR的主要原因。通过荧光原位杂交技术发现LRP基因定位于16号染色体短臂16p13.1～16p11.2，与MRP的基因位置相近。LRP基因长2.8kb。LRP基因测序表明，氨基酸序列有87.7%与褐鼠的穹窿体主蛋白(majorvaultprotein，MVP)具有同源性，因此LRP可能是人的MVP。（2）Pgp、MRP及LRP的组织分布与生理功能Pgp在大多数正常组织中含量较少，但在肾上腺、胰腺、肝、肾、空肠和结肠中有较高水平的表达。Pgp在肝和胰腺主要分布于小胆管、小胰管腔面，肾脏为近曲小管腔面，空肠和结肠为黏膜上皮的肠腔面。Pgp在上述组织中的这种极性分布可能与胰液分泌以及体内毒物从尿液、胆汁和肠腔中排出。此外，大脑和睾丸血管内皮亦高度表达Pgp，而在其他血管中末见Pgp表达。MRP主要分布在肺、肌肉组织、睾丸和外周血单个核细胞内，而在肝脏、大肠、十二指肠、肾脏、卵巢、胎盘和脑组织等表达较低。MRP主要定位于细胞膜上，内质网、高尔基复合体亦有少量分布。MRP的底物是与谷胱甘肽的亲脂性复合物以及阴离子残基，包括白细胞三烯C4、D4、E4，以及S-（2，4-二硝基苯酚)谷胱甘肽。此外，某些两性阴离子化合物，尤其是谷胱甘肽、葡萄糖酸酯及硫酸盐等的偶合物是MRP的底物。在剔除MRP基因(Knock-out)模型研究中发现，MRP对于谷胱甘肽结合物的转运具有重要作用。MRP2主要表达在肝细胞的毛细胆管膜上，正常肾脏小管细胞的管腔膜以及空肠、十二指肠上亦存在。突变小鼠(TR-/GY或EHBR)肝细胞小管膜上缺乏MRP2蛋白表达，则表现为Dubin-Johnson综合征。MRP3主要分布在肝、结肠、小肠和肾上腺，而胰腺、肾脏和前列腺中有少量分布。MRP3在肝脏中定位于肝内胆管上皮细胞膜以及门脉周围的肝细胞膜。MRP6主要分布在肝和肾脏。目前有关MRP2～5的生理功能仍不甚清楚。LRP在人体多种组织中表达，如肾上腺皮质、支气管内皮细胞、肠黏膜细胞、近曲小管、复层上皮等组织，肝胆小管末见LRP。LRP在上述组织的分泌或排泄功能中可能具有重要作用。（3）Pgp、MRP和LRP与MDR机制Pgp是能量依赖的外排泵，能将细胞多种亲脂性药物(如长春新碱、柔红霉素、多柔比星、丝裂霉素、VP-16等)从肿瘤细胞内泵出细胞外，从而导致肿瘤细胞多种耐药性。Pgp作用的底物为非结合形式的药物。Cole报道，MRP亦是能量依赖的外排泵。MRP主要转运以谷胱甘肽、葡萄糖酸酯或硫酸酯的结合物形成的抗癌药物，亦可以药物原型形式转运。Kool等在胃癌细胞株上发现MRP2mRNA水平增高。MRP2可致肿瘤细胞对某些化疗药物(如顺铂、长春新碱)产生耐药性。Kool发现MRP3可引起转染细胞对甲氨蝶呤、依托泊苷的耐药性。由于MRP3对GSH的亲和力小于MRP1和MRP2，所以MRP3转运某些有机分子的能力相对低，致MRP3的耐药谱比MRP1和MRP2窄。MRP4、MRP5和MRP6与MDR无关。LRP与MDR：①使那些以细胞核为靶点的药物不能通过核孔进入细胞核，有些药物即使进入了核内亦被转运到胞质中；②使细胞质中的药物进入运输囊泡，并通过胞吐机制排出细胞外。LRP介导以DNA为靶点的抗癌药物耐受，如顺铂、卡铂和烷化剂等，这些药物耐受性不能由Pgp和MRP介导。应用逆转录PCR和双酶标免疫组化技术发现，在MDR同一细胞株上同时存在mdr1、mrp基因及Pgp和MRP表达，说明多药耐药机制的复杂性和多样性。（4）Pgp、MRP和LRP的临床意义Pgp、MRP和LRP蛋白及其基因表达水平与人类肿瘤原发性和获得性耐药有关。Yeh研究了Pgp在胃癌中表达与化疗疗效（含柔红霉素或依托泊苷的方案）之间的关系，发现30例患者中3例Pgp阳性，其中无一例化疗有效，但27例阴性中19例化疗有效(P=0.041)，说明Pgp与胃癌化疗反应相关。Ichiyshi等研究发现胃癌中MRP表达者则对阿霉素和Etoposide等耐药。Endo在4种胃癌细胞株、43例胃癌组织及17例癌旁正常组织中,RT-PCR、Southern杂交及免疫组化结果表明，MRP在胃癌组织中阳性表达为53.5%，在正常胃组织中为88%，在胃癌细胞株中为75%（3/4株）。MTT法测定了标本对顺铂、柔红霉素和VP-16的敏感性。结果表明，不表达MRP的对柔红霉素、顺铂和VP-16较敏感。4种胃癌细胞株中MRP表达阴性者对顺铂、柔红霉素和VP-16较敏感。最近的研究发现MRP2、MRP3与柔红霉素、顺铂、长春新碱等耐药性有关。(二)p53与胃癌耐药P53是目前与化疗敏感关联较高的基因，不仅与凋亡和DNA修复有关，而且在恶性肿瘤中突变率最高。（1）p53与细胞周期阻滞p53可引起G0/G1期和G2/M期阻滞：（1）由野生型p53激活片段（WAF1）基因产物p21介导G0/G1期阻滞。p21为周期素依赖性蛋白激酶抑制剂，p21水平增高，导致Rb蛋白磷酸化不足，阻止转录因子E2F活性，因此细胞周期阻滞于S期前。（2）调节增殖细胞核抗原（PCNA）。p21作用于DNA聚合酶Ⅱδ和Ⅱε的辅助因子PCNA，使PCNA受抑，G1和G2期阻滞。另一受p53调控并影响细胞周期动力学的基因是GADD45（growtharrestDNAdamage），其通过结合PCNA抑制DNA合成，并有DNA修复的作用。近期还发现p53还有p21非依赖性G0/G1期阻滞，涉及一个“Siab”的蛋白家族。（3）p53及其效应因子p21尚参与细胞周期第二检测点G2/M过度期协调，主要发生于pRb阴性细胞，否则，p21仍以介导G1期阻滞为主。（4）p53调控的14-3-3σ蛋白是DNA损伤制剂诱导的强表达蛋白，其功能是导致G2期阻滞。G2/M阻滞的细胞更易导致凋亡。在正常细胞和肿瘤细胞都存在药物诱导p53表达所致细胞周期阻止现象。（2）p53对细胞凋亡的调控p53激活凋亡途径,一是p53依赖的序列特异性反式激活（SST）途径，诱导表达p53下游的凋亡相关基因，p53诱导凋亡的主要途径；另一途径是非SST性凋亡，p53与涉及DNA合成、修复及凋亡的蛋白结合成蛋白复合体