蛋白类生物活性物质-吉林大学课程中心

蛋白类生物活性物质第二章吉林大学功能性食品教学团队本章要点1.免疫球蛋白2.乳铁蛋白3.溶菌酶4.大豆球蛋白5.金属硫蛋白6.蛋白酶7.生理活性肽第一节免疫球蛋白免疫球蛋白（Immunoglobulin，简称Ig）是一类具有抗体活性，能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。（一）Ig的定义一、Ig的基本概念（二）Ig的结构和组成1、基本结构2、IgG的氨基酸组成一、Ig的基本概念表1－1IgG和IgY的氨基酸组成单位：％（质量分数）IgYIgYIgGIgGAsp6.96.86.78.1Thr8.38.38.59.9Ser12.312.412.714.4Glu9.39.28.89.2Pro7.57.17.16.8Gly9.89.99.97.7Ala8.08.08.45.41/2Cys2.32.52.52.2Val7.57.57.88.4Met1.01.01.00.9Ile3.13.13.12.6Leu8.28.28.26.9Tyr3.23.23.34.0Phe2.82.82.82.7Lys3.53.53.25.5His1.61.61.31.6Arg4.84.74.73.7氨基酸种类普通母鸡免疫母鸡鸡血牛乳（三）Ig的分类与命名1.同种型（Isotype）2.同种异型（Allotype）3.独特型（Idiotype）同种型是指同一种属所有正常个体免疫球蛋白（Ig）分子共同具有的抗原特异性标志。一、Ig的基本概念1、同种型（Isotype）①类和亚类：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE,分别以希腊字母γ、α、δ、η和ξ表示IgG有4个亚类即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA有IgA1和IgA2两个亚类，IgM有IgM1和IgM2两个亚类，IgD和IgE尚未发现有亚类。②型和亚型：分为κ和λ两型。同种异型是指同一种属不同个体所产生的同一类型Ig由于重链或轻链恒定区内一个或数个氨基酸不同（即遗传标志不同）而表现的抗原性差异。目前已在IgG和IgA重链（γ和α）恒定区及κ型轻链恒定区中发现有决定同种异型抗原特异性的遗传标志，简称为同种异型标志。2、同种异型（Allotype）独特型是指不同B细胞克隆所产生的免疫球蛋白分子V区和T、B细胞表面抗原（识别）受体V区所具有的抗原特异性标志。3、独特型（Idiotype）二、Ig的分布表1－2不同动物乳汁、血清中Ig的含量种类免疫球蛋白浓度／mg·mL-1Ig主要成分含量／％血清初乳常乳血清初乳常乳人IgG12.10.430.0478IgA2.517.351.009087IgM0.931.590.109676－狗IgG11.123.40.248168IgA0.79.82.6385IgM1.70.80.22猪IgG21.558.73.08980IgA1.810.77.770IgM1.13.20.3马IgG（总）21.9113.40.398988IgG（T）8.215.20.0943IgA1.510.70.48IgM1.25.40.03牛IgG（总）25.032～2120.72888566IgG114.020～2000.6IgG211.012.00.12IgA0.43.50.13IgM3.18.70.04表1－3在各种体液中免疫球蛋白的含量单位：mg／dL种类IgAIgGIgMIgA／IgG血清2001.301200.15耳下腺唾液3.950.0360.043109颚下腺唾液4.50.040.06112鼻液2010痕量2鼻液（刺激后）144160.89汗0.83.2～00.25初乳（人）600305020泪20痕量～0－胃液562032.8肠液150140－胆汁160145－1.1前列腺分泌液26150－0.3腔分泌液6.336－0.2羊水1.621－0.76脑髓液1.87.9－0.08十二指肠液231.21.519.2空肠液160221.57.3粪便171317尿／mg·d－11.13.0－0.37支气管分泌液8.2～705.6～60－1.5三、牛乳中的Ig牛初乳:存在IgG、IgA、IgM、IgE和lgD等5类.lgD没有作为功能性食品的潜力。牛初乳：IgG占Ig总量的55％以上。牛血清：IgG占Ig总量的75％～80％。多以单位形式存在，分子质量为149680。IgG更是惟一能通过胎盘的抗体。婴儿出生后3个月内不能合成IgG。表1－4牛乳和人乳免疫球蛋白含量比较单位：g/L免疫球蛋白牛乳人乳初乳常乳初乳常乳IgG0.400.04IgG147.600.60－－IgG22.900.02－－IgA（SIgA）3.900.1417.401.00IgM4.200.051.600.10表1－5人、牛的Ig主要理化性质和生物学活性理化与生物活性IgGIgMIgA／SIgAIgDIgE分子质量15000090000016000／390000185000190000沉降系数（S＊）7197／1178重链类γμαδε亚类γ1、γ2、γ3、γ4μ1、μ2α1、α2－－轻链型κ、λκ、λκ、λκ、λκ、λ主要存在形式单体五聚体单体或二聚体单体单体抗原结合价25～102～422半衰期（天）235633体内开始形成时间出生后3个月胚胎末期出生后4～6个月较晚较晚生物学活性通过胎盘、激活补体、抗菌、无抗体活性亲细胞活性激活补体、抗菌、抗病毒、亲细胞活性、抗病毒粘膜局部免疫调理作用、抗菌、抗病毒四、Ig的生物学功能（一）与相应抗原特异性结合（二）活化补体（三）结合细胞产生多种生物学效应（四）通过胎盘传递免疫力表1－6各种Ig的生物学功能功能IgMIgDIgG1IgG2IgG3IgG4IgA1IgA2IgE活化补体（经典途径）＋＋＋－＋＋＋＋＋＋－－－－活化补体（旁路途径）－－－－－－－－－胎盘通过性－－＋＋＋＋＋＋－体外分泌＋－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋－结合细胞中性粒细胞－－＋－＋＋＋＋＋－嗜酸性粒细胞－－＋？＋？－－＋嗜碱性粒细胞－－－－－－－－＋淋巴细胞＋＋＋＋＋＋＋＋＋乳突细胞－－－－－－－－＋＋＋血小板－－＋＋＋＋－－？巨噬细胞－－＋－＋－－－＋IgM凝集反应的主体IgD在淋巴细胞表面存在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4在血管外体液中含量最多，对异物反应IgA1、IgA2、IgE在消化道、气管表面存在，对异物反应表1－7Ig能抑制的微生物和毒素微生物毒素ShigelladysenterInfluenvirus（毒素）Shigellaflexncri1DiptheriatoxinShigellaflexncri6TetanustoxinShigellasonneiStreptolysinSalmonelaPolivirus（毒素）Escherichiacolioill：B4BacteroidesfraglisStreptococciPneumococci第二节乳铁蛋白（Lactoferrin，Lf）一、Lf的基本性质二、Lf的生物活性及其影响因素三、Lf的分离方法一、Lf的基本性质（一）Lf的基本结构和组成1939年，Sorensen等人在分离乳清蛋白时得到一种红色蛋白；1959年Groves用色谱法得到纯的红色物质后，才确认这种红色物质是一种含铁蛋白质，称之为乳铁蛋白（Lactoferrin，Lf），又称红蛋白。一、Lf的基本性质乳铁蛋白是一种天然蛋白质的降解物，存在于牛乳和母乳中。乳铁蛋白晶体呈红色，是一种铁结合性糖蛋白；相对分子质量为77100±1500。牛乳铁蛋白的等电点（pI）为8，比乳铁蛋白高2个pH单位。在1分子乳铁蛋白中，含有2个铁结合部位。其分子由单一肽键构成，谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和丙氨酸的含量较高；除含少量半胱氨酸外，几乎不含其他含硫氨基酸；终端含有一个丙氨酸基团。一、Lf的基本性质通过Lf的组成和氨基酸顺序分析，证明它是由转铁蛋白（Transferrin，Tf）演变而来。1分子Lf能结合两个Fe3＋离子，含15～16个甘露糖，5～6个半乳糖，10～11个乙酰葡萄糖胺和1个唾液酸，其中中性糖8.5％，氨糖2.7％。乳清Lf和初乳Lf有相同的性质。X光衍射实验（XRD）表明，其主体呈无柄银杏叶并列状结构，铁离子结合在两叶的切入部位，Fe离子的间隔为0.28～0.43μm，椭圆形叶的大小为0.55μm×0.35μm×0.35μm。（二）Lf的金属结合性质1分子饱和Lf中含两个Fe3＋离子。乳铁蛋白不仅能结合Fe3＋，且对Cu2＋也有结合作用，其结合能力也是每个Lf分子含两个Cu2＋。在乳铁蛋白和Fe或Cu形成络合物的过程中有碳酸氢盐的参与，Fe或Cu和碳酸氢盐的比例为1︰1，碳酸氢盐的存在对络合物的生成有催化作用。维生素C对缺铁Lf的饱和过程也有催化作用，维生素C的存在有利于饱和Lf的形成，Tf也有类似的性质。用XRD实验证实，Tf的铁结合2个酪氨酸，1个组氨酸，1个天冬氨酸和碳酸根，碳酸根上连接1个精氨酸和水分子，这种模式是否和Lf一样，尚需实验的进一步证实。一、Lf的基本性质一、Lf的基本性质（三）Lf的热力学性质对加热Lf的抗原性和其它生物活性进行分析的结果表明：缺铁乳铁蛋白pH7时胶凝，pH7时不沉淀，pH＝4.0时90℃～100℃、5min的加热，对Lf的铁结合能力、抗菌性没有影响；在pH2.0～3.0，100℃～120℃，加热5min后，Lf明显地降解，但其抑菌活性反而增强。二、Lf的生物活性及其影响因素（一）Lf的生物活性①刺激肠道中铁的吸收。②抑菌作用，抗病毒效应。③调节吞噬细胞功能。④调节发炎反应，抑制感染部位炎症。⑤抑制由于Fe2＋引起的脂氧化，Fe2＋或Fe3＋的生物还原剂（如抗坏血酸盐）是脂氧化的诱导剂。（二）Lf生物活性的影响因素①铁饱和程度的影响：乳铁蛋白的铁含量对抑菌有决定性作用，如从乳房炎中分离的大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌类在一定的合成介质中均被缺铁乳铁蛋白抑制，这种抑制作用因加入Fe3+使其饱和而消失，说明了乳铁蛋白抑菌作用的铁依赖性，它的抗脂氧化有类似结果。二、Lf的生物活性及其影响因素（二）Lf生物活性的影响因素②盐类作用：在上述实验中，碳酸盐的存在可明显增强乳铁蛋白的抑菌能力，柠檬酸盐的增加明显减弱了缺铁乳铁蛋白对三种菌的抑制。乳汁的实际抑菌作用和其分泌的乳铁蛋白与柠檬酸盐的比例有关，其实质仍是二者竞争Fe3+使微生物可对铁利用，因而减弱了抑制能力。（二）Lf生物活性的影响因素③pH的影响：乳铁蛋白的抑菌效果和pH密切相关，在pH7.4时效果明显高于pH6.8，pH6基本无抑菌作用。④抗体或其它免疫物质间的协同作用：研究表明乳铁蛋白和IgA抑菌有协同作用，Sarllson等人也得出相同结论。（二）Lf生物活性的影响因素⑤介质的作用：金黄色葡萄球菌用I125示踪蛋白实验表明：85％能和Lf稳定结合，其它部分很少或不能结合，其介质以血液、胨—琼脂较好，盐汁或富盐脱脂乳较差，最适pH为4.0～7.0。⑥形态：Lf的生物活性和其形态有关，如10％水解的Lf有最好的抑菌效果，HPLC法分析有8种Lf的降解肽存在（二）Lf生物活性的影响因素⑦动物的种类：Lf的活性和动物的种类相关，人、牛、羊等乳汁中Lf的含量和结构稍有不同，在许多体液、组织液（如唾液、鼻汁、胆汁、精液、泪等）均有Lf存在，它们在这些部分参与生物调解作用。三、Lf的分离方法吸附色谱法离子交换色谱法亲合色谱法固定化单系抗体法超滤法第三节溶菌酶溶菌酶（Lysozyme，Lz，EC（3.2.1.17））又称胞壁质酶（Muramidase）或N—乙酰胞壁质聚糖水解酶（N—Acetylmuramideglycanohydralase）Lz是一种碱性球蛋白。对热稳定性很高。母乳中的Lz活力比鸡蛋清Lz高3倍，比牛乳Lz高6倍。Lz是由129个氨基酸组成，相对分子质量14200，等电点为pH10.7～11.0，分子内有4个二硫键交联，对热极为稳定。Sh