12、血清谷丙转氨酶活性的测定

血清谷丙转氨酶活性的测定（King法）【目的要求】1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。【原理】生物机体内转氨基作用是α-氨基酸的氨基通过酶促作用转移到α－酮酸的酮基位置上，生产相应的酮酸和氨基酸的化学反应。催化这反应的酶称为转氨酶（transaminase），其辅酶为磷酸吡哆醛。转氨酶广泛存在于机体的各种组织中，在肝、心、肾等组织中的谷丙转氨酶（glutamicpyruvictransaminase,GPT），谷草转氨酶（glutamicoxalacetictransaminase,GOT）活性较高。在正常的新陈代谢过程中，血清内维持一定水平的转氨酶活性（即正常值）。当肝、心、肾等组织发生病变时，由于组织细胞肿胀，坏死导致大量的酶释放至血流中，从而引起血清谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）活性显著升高。因此测定这些酶的活性对某些疾病的临场诊断具有重要的参考价值。血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中ALT的活性。King氏法谷丙转氨酶活性单位：每毫升血清在37℃与pH7.4的基质液作用60min，生成1μmol丙酮酸为一个单位。临床检验取血清量为0.1mL，报告数据以100mL血清计算，因此实际测得结果乘1000即可。例如0.1mL丙酮酸标准液中丙酮酸含量为0.2μmol，即相当GPT200U/100mL。试剂与器材1、样品动物或人血清2试剂1)甲液（1/15mol/L磷酸氢二钠溶液）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4，A.R.）9.47g或含十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O，A.R.）23.87g溶于蒸馏水中定容至1000mL。2)乙液（1/15mol/L磷酸二氢钾溶液）称取磷酸二氢钾（KH2PO4，A.R.）9.078g溶于蒸馏水中定容至1000mL。取甲液825mL，乙液175mL混合，此液PH应为7.4。3)GPT基质液称取α－酮戊二酸29.2mg（2mmol/L）及α－DL－丙氨酸1.78g（200mmol/L）溶于50mLpH7.4的磷酸缓冲液中，加0.1mol/LNaOH溶液约0.5mL，调节pH为7.4，然后加磷酸缓冲液定容至100mL。加少许氯仿防腐，置冰箱中保存。4)2，4－二硝基苯肼（1mmol/L）称2，4－二硝基苯肼20mg。先溶于10mL浓盐酸中，使其溶解。再以蒸馏水定容至100mL。5)丙酮酸标准液精确称取丙酮酸钠22mg。加磷酸缓冲液溶解后定容至100mL。此溶液浓度为2μmol/mL，临用前配制。0.4mol/LNaOH溶液，1/15mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）。3、器材试管及试管架，移液管（0.5mL，1mL，5mL），量筒（10mL，100mL），恒温水浴，722型分光光度计，坐标纸。实验内容和步骤1)制备标准曲线2)绘制标准曲线以光吸收值为纵坐标，酶活性单位数为横坐标，在坐标纸上绘制各测得A520值与对应的酶活性单位数的标准曲线。3)样品测定结果计算标准曲线测定法根据样品管A520值（已减去空白管A520）查标准曲线，即得每100mL血清中转氨酶活性单位数。标准管测定法每次测定酶活性时，同时用丙酮酸标准液（2μmol/mL）0.1mL，平行操作，即按上表操作，不做标准曲线，测定A520按下公式计算：比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun法）和赖氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。不同之处在于作用时间：King法60min，Mohun法和Reiman法30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是：每1ml血清在37℃条件下与底物作用60min，生成1μmol丙酮酸称为一个单位。Mohun法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作用30min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质的量浓度，而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系：1卡门氏单位=0.4821IU/L(25℃)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较为一致，能较好反映酶的真实活性。由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后，新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。注意事项1)为防止溶血及其他因素对酶活性测定的影响，实验过程所用的一切器皿（注射器、试管等）应清洗干净，干燥后方能使用。2)空腹取血，避免血脂干扰。迅速分出血清，及时测定。3)作为标准物质的丙酮酸钠极易变质。配试剂时应选择外观洁白干燥者。若颜色变黄或潮解，则应重结晶，干燥至衡重后再用。丙酮酸钠重结晶：取纯丙酮8份与蒸馏水2份混合，加入变质的丙酮酸钠使其达到饱和。此时溶液上层无色，下层有棕黄色油状物。取出上层无色液体置烧杯中，加入两倍体积的丙酮（无水）混匀后，置冰箱中数小时，则有白色丙酮酸钠析出，用布氏漏斗收集沉淀，并用纯丙酮洗涤两次，抽干后，置干燥器内，保存、备用。4)转氨酶只能作用于α－L－氨基酸（L－天冬氨酸，L－丙氨酸），对D－氨基酸无催化作用。实验室多用α－DL氨基酸（因较L－氨基酸价廉），如采用α―L―氨基酸,则需按α－DL氨基酸的用量减半。5)为保证操作结果可靠，测定酶活性时应恒定PH，保温时间，选用固定的比色计，比色杯以减少误差。6)血清转氨酶活性高于500（U）/100mL血清时，应将血清稀释一定倍数重新测定，其结果应乘以稀释倍数。7)每次测定样品数不要太多，其数量以在显色后30min内完成比色为宜。