单个细胞分离技术PBMC

美丽的海医校园临床免疫学实验指导海南医学院实验六单个核细胞分离及细胞免疫功能检测【实验目的】1.熟悉淋巴细胞分离方法2.了解T淋巴细胞亚群测定方法及其临床意义T细胞介导的免疫应答特征：是T细胞辅助细胞（Th1）介导的单个核细胞（L,M），以浸润为主的炎症反应与细胞毒性T细胞（CTL或TC）发生特异性细胞毒效应.临床上反复感染者和肿瘤病人，使人首先想到的是：患者是否有细胞免疫缺陷，必须进行细胞免疫缺陷的检测，而这种检查的第一步就是单个核细胞的分离，计数。然后进行功能检查。一、单个核细胞分离法（主要为淋巴细胞）（一）葡聚糖—泛影葡胺法分离单个核细胞•密度梯度离心法：水平离心机，逐渐加速，自然停转1.分离液：葡聚糖-泛影葡胺混合液（比重1.075～1.092之间）将分离液，加入抗凝血中离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。比密大在底部，小的在上部。◆红细胞和多核白细胞比重较大（1.092），分布于最底层，◆单核细胞比重较小（1.075～1.090），分布于血浆与分离液的交界处。界限清楚，层次分明。将该层细胞吸出，即为单个核细胞（主要为淋巴细胞）◆血浆和血小板位于最上层。血小板在血浆中下部2.Hanks缓冲液：（pH7.2-7.4,无Ca、Mg离子）3.0.4%台盼蓝染液梯度离心法——分离提取单个核细胞稀释血浆内含血小板分离液粒细胞红细胞用细长吸管慢慢插入白膜层，沿管壁周边轻轻吸取单核细胞层于另一试管内加入PBS洗液3-4ml，离心洗涤2次，1500/r,10min.弃去上清，留约50μl.加含有10%灭活小牛血清-PBS液1.0ml，混匀充池，镜下计数。单个核细胞2000rpm/20-30min肝素抗凝血2ml+Hank’s液2ml液稀释沿管壁缓慢加入到含有2ml淋巴细胞分离液的试管中(不能破坏二者的液面）,2000r/min离心20min吸出淋巴细胞层加入另一试管中，加3～4mlHank’s液，混匀离心洗涤，1500r/min离心10min弃去上清，再加3mlHank’s液，混匀，1500r/min10min，重复洗涤2次重复1次末次离心后，弃去上清液。加含10%灭活小牛血清/HanK‘s液加至1.0ml，混匀，灌入血细胞计数池，单个核细胞计数，于低倍镜下计数4个角大格内细胞总数。方法留取约50μl,加缓冲液至1.0ml，稀释20倍计数细胞方法加样：将淋巴细胞悬液混匀，吸取10μl加入到40μl含10%灭活小牛血清的Hank’s液中，混匀后再吸取10μl充入计数板上。细胞悬液稀释5倍。此稀释也可省略，可根据细胞密度而定静置片刻，置显微镜下计算淋巴细胞数。具体计数方法如下：▲血细胞计数池的构造1.大方格9个2.中方格分2种WBC计数区分16个RBC计数区分25个3.小方格1种，是指RBC计数区的1个中方格又分16个小方格，即：计数池内有：1种大方格；2种中方格；1种小方格池深0.1mm血细胞计数池的构造参数4种方格的体积（容积）计数池区域边长（mm）面积（mm2）池深（mm）体积（mm3ul）一个计数全池390.100.90大方格110.100.10白细胞中方格0.250.06250.100.00625红细胞中方格0.200.04000.100.00400红细胞小方格0.050.00250.100.00025细胞计数原则计左上，不计右下血细胞计数板血细胞计数板上四个角的四个大方格1个大方格中16个中方格计数血细胞计数板上四个角的四个大方格内单个核细胞总数。（只计算上边和左边的压线细胞，右边和下边压线细胞不计算）单个核细胞总数计算：是指最终制备的每ml细胞缓冲液内的单个核细胞的密度（数量）单个核细胞总数/ml=单个核细胞总数/ml=X/4×10×(稀释倍数)×103=X×10444个大方格内细胞总数×稀释倍数×104关于稀释倍数：这里不是指血液稀释倍数。是指最后洗涤离心弃去上清液后的单个核细胞沉淀中，加入缓冲液1.0ml后。此缓冲液中的单个核细胞密度。细胞存活率检测取10μl淋巴细胞悬液加入0.4%台盼蓝染色液10μl，混匀。取10μl加入血细胞计数板，静置片刻，置显微镜高倍镜下观察。计数200个单个核细胞分别记录活细胞数，死细胞数，带入计算公式，报告活细胞存活率。【结果判定】活细胞不着色，折光性强。死细胞由于染料可渗入细胞内，故死细胞被染成蓝色，体积较大，无光泽正常情况下，活细胞存活率应在95%以上。表明免疫活性细胞数量正常。然后做其他功能检测•在高倍镜下计数200个细胞中的死亡细胞数，计算其存活率：使用血细胞计数器：细胞存活率=活细胞数(N)活细胞数+死细胞数200×100%例如：活细胞总数为120个，存活率为：60%；若活细胞计数为180个，存活率：90%【临床意义】分离单个淋巴细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一，是进行流式细胞分析技术的重要的前期基本操作；是进行各项免疫细胞功能检测的基础技术。分离所得的单个核细胞可满足许多实验需要，不仅用于淋巴细胞总数和细胞的存活率测定，也用于进一步纯化淋巴细胞，进行淋巴细胞分类，分群，表面抗原，各种标志物以及其他淋巴细胞功能测定等。实验报告：1.报告单个核细胞计数总数结果2.报告单个核细胞存活率3.简述密度梯度离心法分离单个核细胞的原理4.分离单个淋巴细胞的临床意义T细胞总数测定：Et花环实验。学生课余自学内容。E+淋巴细胞百分率测定：正常人参考值：60%-80%由于干扰因素较多，主观因素影响，临床意义不明显结果不稳定，重复性不高等原因，很少做。T细胞总数测定——Et花环沉降法（E+淋巴细胞百分率：60-80%）人类T细胞的主要标志的CD2、CD3和TCR均能吸附绵羊红细胞于淋巴周围，形成花瓣样排列称为E花环实验。实验报告：1.报告单个核细胞计数总数结果2.报告单个核细胞存活率3.简述密度梯度离心法分离单个核细胞的原理4.分离单个淋巴细胞的临床意义实验课结束啦！可以轻松的玩一玩啦！