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药品微生物检验用菌种的传代和保藏浙江省药品检验所叶铭龙2菌种的定义及其与各应用领域的关系菌种泛指从自然界获取的各种微生物的不同的种。医学领域研究菌种主要考虑其致病机理工业生产研究菌种主要考虑其发酵机理药品微生物检验主要考虑其标准性3标准菌种的概念及其管理标准菌种是指由国家授权机构制备的具有稳定的生物学特性并用妥善方法保藏的菌种。我国的标准菌种统一由中国菌种保藏管理委员会（CCCCM）管理，涉及药品微生物检验的菌种由医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）提供4标准菌种的保藏形式我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式包装于熔封的厚玻璃容器中。在这种容器中，微生物通常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须的环境条件，一般呈休眠状态。5纯培养所谓微生物的纯培养是指在一个微生物的菌落形成单位中，所有的微生物细胞或孢子都属于生物学的同一个种。严格地说，纯培养是在培养基上由一个细胞或孢子分裂、繁殖而产生的后代。在该细胞或孢子的生长过程种，不受其他微生物的侵犯，不会在培养物中产生另外微生物种的后代，在整个生长过程中不发生变异或死亡。6获取纯培养的工作环境1、洁净工作室：环境洁净度10000级下的局部100级的单向流空气区域内，全过程必须无菌操作，防止微生物污染。2、无菌隔离舱7获取纯培养的接种工具1、接种环2、接种针3、接种铲4、接种钩5、其他玻璃器械8获取纯培养的其他器具1、玻璃器皿：如各种规格培养皿。2、微生物实验室常用的设备，如高压灭菌锅、恒温培养箱等9获取纯培养的主要技术－移植（又称接种）微生物的移植（或称接种）是指将微生物接种在培养基上的操作。10移植（又称接种）的两种方式－划线和穿刺1、划线法是指用接种工具将微生物细胞移植在固体培养基斜面或平板上的一种方法。2、穿刺法是指用接种工具将微生物细胞移植到固体或半固体培养基内的一种方法。11影响集菌培养效果的若干因素温度渗透压氧气光pH值和氧化还原电位培养基抗生素12验证纯培养的主要依据1、用显微镜观察时，全部的生物个体是相似的，如果是细菌，对革兰氏染色反应应当是一致的。2、将培养物制成悬液，重新倾注平板，或平板划线培养后，所形成的全部菌落的形态应该是相似的。如果是细菌，将重新形成的菌落各作穿刺培养，其培养特征应当是一致的。3、从重新分离的各菌落作生理特征观测时，如对氮源的利用，对糖类的发酵或同化以及其他生理生化的测定，应呈现出一致性。13定期移植保藏法一般步骤为：将菌种接种在所要求的培养基上，置最适温度下集菌培养。得到健壮的菌体（如有性孢子、无性孢子或细胞等）后，放于温度较低、干燥处保藏，并且每隔一定时间重新移植培养一次。14定期移植保藏法1、细菌置4～6℃保藏，芽孢杆菌每3～6个月移植一次，其他细菌每月移植一次。2、放线菌于4～6℃保藏，每3个月移植一次。3、酵母菌于4～6℃保藏，每4～6个月移植一次。4、丝状真菌于4～6℃保藏，每3个月移植一次。5、担子菌于4～6℃保藏，每3个月移植一次。6、保藏的湿度通常在50％～70％为宜。15定期移植保藏法1、需定期检查2、移植进行时，应仔细核对3、集菌培养完成后，应比较培养特征4、应注意观察各代之间的变化16琼脂斜面低温保藏法1、菌种的典型菌落接种至斜面，规定的温度和时间培养，充分生长，硅胶塞换成无菌橡胶塞。4～6℃冰箱保藏a:1～3个月移植一次，继续保藏。b:用半固体高层培养基穿刺培养，可保藏半年至一年。17琼脂斜面低温保藏法适用细菌、霉菌、酵母菌及放线菌保藏优点：简便、大多数微生物适用缺点：保藏期短；传代次数多；容易发生变异及污染。生孢梭菌用硫乙醇酸盐培养基、乙型溶血性链球菌及肺炎球菌用血肉汤（琼脂）培养基18液体石蜡保藏法一般步骤为：准备液体石蜡并灭菌去水备用。获得需要保藏菌种的纯培养，将液体石蜡注入培养容器中，并完全覆盖培养基。液体石蜡液面以高出培养基上端0.5～1cm为宜4～6℃冰箱保藏19液体石蜡保藏法确保保藏环境的干燥，避免长霉。使用此法保藏的菌种时应特别注意防止微生物外溅污染。该法对酵母菌的保藏最为有效，对大多数细菌保藏效果一般。20甘油冷冻保藏法将保藏菌种接种琼脂斜面上，适宜温度下培养适宜时间，用无菌接种环轻轻刮取菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦使菌种充分扩散到无菌水中，调证菌液浓度，向已制备好的菌悬液加入等体积的20％无菌甘油，轻轻振试管管，使内容物充分混合，分装于无菌小管。甘油冷冻管最好在-30℃贮存。21沙管保藏法制备沙管培养接种制备菌悬液混菌干燥保藏适合保藏芽孢杆菌、梭菌、放线菌和一些丝状真菌。22土壤保藏法用土壤替代沙管保藏法中的河沙，其余操作与沙管保藏法相同适合保藏土壤细菌、放线菌和丝状真菌，时间为2～6年。23硅胶保藏法用硅胶替代沙管保藏法中的河沙，其余操作与沙管保藏法相同适合保藏酵母菌和某些丝状真菌24滤纸保藏法保藏微生物细胞或孢子的载体为滤纸。对细菌、酵母菌、丝状真菌等都有一定的效果，有些菌种最长可达17年。25明胶片保藏法制备无菌营养明胶制备无菌石蜡滤纸微生物培养并制成浓厚的悬液在悬液中加入营养明胶将含微生物细胞或孢子的营养明胶滴于石蜡滤纸表面干燥将形成的明胶片密封保藏26麸皮保藏法我国历史悠久的微生物保藏法适于保藏根霉、曲霉、青霉、红曲霉等属和赤霉菌27梭氏真空干燥保藏法在小试管中放置菌悬液小试管在大试管中放置大试管在真空状态下干燥密封大试管28液体直接干燥保藏法需要加入保护剂干燥之前不需冻结在干燥过程中为增大蒸发面积，可加入多孔材料干燥后的容器应熔封29蒸馏水保藏法最为简便的微生物保藏法微生物细胞或孢子保藏在蒸馏水中保藏的容器应密封适于保藏棒状杆菌、土壤杆菌和假单孢菌等30液氮冰箱超低温保藏法需专用设备－液氮超低温冰箱菌悬液密封于安瓿管内，控速冻结国外已普遍采用保藏时间长31冻结真空干燥保藏法历史悠久，又称冻干法不产生孢子只产生菌丝体的丝状真菌不宜采用该法适用面广保藏时间可达10年以上多为菌种保藏机构采用32冻结真空干燥保藏法密封性好，可避免保藏期间的污染保藏容器体积小，方便携带和贮藏保藏时间更长，变异概率更低33普通微生物实验室适用的保藏技术琼脂斜面低温保藏法液体石蜡保藏法低温冷冻保藏法甘油冷冻保藏法34琼脂斜面低温保藏法细菌置4～6℃保藏，芽孢杆菌每3～6个月移植一次，其他细菌每月移植一次。放线菌于4～6℃保藏，每3个月移植一次。酵母菌于4～6℃保藏，每4～6个月移植一次。丝状真菌于4～6℃保藏，每4个月移植一次。担子菌于4～6℃保藏，每3个月移植一次。保藏的湿度通常在50％～70％为宜。35菌种保藏的一般规定1、菌种“代”的确定：2005版药典规定，以干燥菌种管为第“0”代，由此得到的第一批子代为第一代，以此类推。2、菌种传代次数规定：2005版药典规定不超过5代。3、菌种应专人保藏、专柜贮藏，认真做好登记，统一编号，按期传代，并做好有关检验记录。4、保存菌种传代或冻干均应填写专用记录，菌种管上应有标签，表明菌种编号、代次、批号、日期。5、过期菌种应及时处理、登记，经121℃30分钟灭菌消毒。36实验室菌种传代操作步骤1、接种前用1：1000新洁尔灭擦拭工作台面，然后开紫外灯消毒30分钟。2、自冰箱取出保存工作用菌种，室温放置20分钟；温度平衡后才能传代。3、实验人员进入缓冲间，换鞋、穿无菌衣、戴口罩，用1：1000新洁尔灭溶液消毒双手，并将培养基及菌种移入阳性菌接种室。4、点燃酒精灯，将菌种管塞子，通过火焰转动使稍稍松动，以免接种时粘着打不开。5、接种操作：左手拿住菌种管，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒，将白金耳烧红约30秒，杆部通过火焰灭菌。挑取少量菌苔；另取，照上述方法在火焰旁打开塞子，将白金耳伸入管内斜面培养基的底部，从下到上将白金耳轻贴斜面培养基的表面作曲折移动。5、接种后，将斜面置规定温度、时间培养。取出观察，菌种生长良好，换橡皮塞，贴上标签，放入冰箱保存。6、细菌一个月传代一次，枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉可三个月传代一次。37菌种管理1、标准菌种必须从认可的菌种收集途经获得；实验室必须建立和保存所有菌种的收集、贮藏、保存、确认试验的记录。2、实验室应有文件管理标准菌种（从原始菌种到工作用菌种）。该程序应包括：a:标准菌种必须定期传代，并做确认试验，包括实验室在所需要关键诊断指标，实验室必须记录并保存。b：每一子菌种都应以适当标签、标记来表示名称、标准号、接种日期和传代日期。C:每一子菌种都应以标记从原始菌种传代到工作用菌种的代数；记录菌种生长的培养基及培养条件；菌种生存条件等。38过期菌种处理过期菌种应及时清理、登记，并经121℃、30分钟高压消毒灭菌。39例1：金黄色葡萄球菌传代保藏技术1、购置金黄色葡萄球菌（如我所提供的菌种为第二代菌种），假定购置日期为5月21日。2、准备10支营养琼脂斜面，其中2支用于保藏，其余8支用于当月实验。3、于5月22日打开菌种管，接种菌种至上述10支斜面，35℃培养16～18小时。4、将10支第三代菌种管做好标签，置适宜温度保藏。5、5月22日至6月22日，可以使用上述第三代菌种管。6、至6月22日，重复步骤2，得第四代菌种管。7、至8月22日前，重新购置原种管。40例2：黑曲霉的传代技术1、制备孢子悬液：取灭菌水或生理盐水3～5ml，分2～3次小心滴加至菌种管内（试管斜面），反复振摇。倾取孢子悬液置另一灭菌试管。2、涂布接种：用灭菌滴管吸取悬液滴加至改良马丁琼脂培养基斜面，每管滴加2～3滴，转动试管，使悬液与斜面表面充分接触41菌种确认试验包括以下几个方面：1、菌落生长情况：目测2、染色镜检：3、生化试验；(1)糖醇代谢试验（2）氨基酸和蛋白质代谢试验（3）碳源和氮源利用试验（4）酶类试验（5）其他试验42短小芽孢杆菌确认该菌未发生变异的主要方法为：1、通过显微鉴别，为不呈链状排列的杆菌，革兰氏染色为阳性。2、营养琼脂斜面上菌苔光滑，薄，闪光，蔓延，不粘着，常常是浅黄色。3、生化试验可选做明胶穿刺、淀粉水解和硝酸盐还原，结果为明胶缓慢液化，淀粉水解阴性，硝酸盐还原阴性。43枯草芽孢杆菌确认该菌未发生变异的主要方法为：1、通过显微鉴别，为呈链状排列的杆菌，不形成荚膜，革兰氏染色为阳性。2、营养琼脂斜面上菌苔生长丰厚，粗糙，不透明，不闪光，蜡质，蔓延，奶油色至微褐色。3、生化试验可选做明胶穿刺、淀粉水解和硝酸盐还原，结果明胶呈漏斗形至层状液化，淀粉水解阳性，硝酸盐还原阳性。44大肠埃希菌确认该菌未发生变异的主要方法为：1、通过显微鉴别，为成对和呈短链排列的近球形的杆菌，一般不形成荚膜，革兰氏染色为阴性。2、营养琼脂斜面上菌苔通常白色，有时带黄白色，湿润，闪光，蔓延生长。3、生化试验可选做明胶穿刺和靛基质试验、甲基红试验、V.P.试验和柠檬酸盐利用试验，结果不液化明胶，靛基质试验和甲基红试验阳性，V.P.和柠檬酸盐利用试验阴性。45大肠埃希菌该菌为微生物限度检查规定不得检出的控制菌，有一整套完整的鉴定手段，也可参考该方法用于判断所保藏的菌种有无发生变异。该鉴定方法主要内容即为经典的IMViC试验，结果为++--。46铜绿假单孢菌确认该菌未发生变异的主要方法为：1、通过显微鉴别，为单个，成对或呈短链排列的杆菌，有运动性，革兰氏染色为阴性。2、营养琼脂斜面上菌苔生长旺盛，薄，白色，闪光，培养基变为绿色至暗褐色或黑色，发荧光。3、生化试验可选做明胶穿刺、吲哚和硝酸盐还原试验，结果迅速液化明胶，液体呈浅黄绿色或浅蓝绿色，吲哚试验阴性，硝酸盐还原试验阳性。47铜绿假单孢菌该菌为微生物限度检查规定不得检出的控制菌，可利用氧化酶试验和绿脓菌素试验迅速判断所保藏的菌种有无发生变异。48乙型副伤寒沙门菌确认该菌未发生变异的主要方法为：1、通过显微鉴别，为单个出现的杆菌，有运动性，革兰氏染色为阴性。2、营养琼脂斜面上菌苔浅灰色，湿润