激光扫描共聚焦显微镜操作手册

北京大学化学学院中级仪器实验室A1R操作说明书激光扫描共聚焦显微镜（A1R-si）操作指南北京大学化学学院中级仪器实验室A1R操作说明书-1-目录第一章：Ti-E显微镜操作2-7显微镜光路调节和照明注意事项6Ti-E物镜，DIC插片，DIC棱镜对照表7第二章：共聚焦开关机8-10第三章：共聚焦图像拍摄11-38NIS-ElementsC软件开启和操作界面简介11-15NIS-ElementsC的实时图像获得基本操作16-23图像拍摄24-27探测模式（标准探测器）设置28-38第四章:图像的保存和查看39-42第五章：图像分析43-46附件一、多维拍摄功能和操作方式介绍47-51附件二：图像格式批量转换操作52-53北京大学化学学院中级仪器实验室A1R操作说明书-2-第一章Ti-E显微镜操作指南（一）认识显微镜各个部件（1）滤光片：包括D---毛玻璃；NCB---色温平衡片；ND---减光片；“GIF”---绿色滤光片和用于PFS的红外滤光片；（2）视场光阑；（3）聚光器升降旋钮；（4）起偏器（DIC用）；（5）聚光器对中旋钮；（6）孔径光阑；（7）聚光器模块（包括明视场，DIC）；（8）滤色块转盘（包括DIC检偏器）；（9）手动荧光光闸；（10）电动焦距调节旋钮；（11）ND减光片；（12）遥控器；（13）透射光电源；（14）汞灯荧光光源；（15）PFS控制器（16）HUB控制器北京大学化学学院中级仪器实验室A1R操作说明书3遥控器示意图(根据具体配置有些图标可能不显示)1）物镜切换按钮；2）滤光块，DIC检偏器切换按钮；3）DIC检偏器快速切换按钮；4）光路端口切换按钮；5）PFS开关控制按钮；6）聚光器转盘切换按钮；7）透射光源控制按钮*。*请注意：CNTL按钮灯亮，则可以通过遥控器或电脑控制软件来调节透射光源强度，此时显微镜底座左侧光源开关和调节旋钮锁定；CNTL功能关闭，可以通过显微镜底座开关和旋钮来控制透射光源。北京大学化学学院中级仪器实验室A1R操作说明书4前面板示意图1）状态显示屏；2）PFS开关按钮和PFS聚焦状态指示灯（需要选购PFS部件）；3）光路端口切换按钮；4）中间变倍旋纽；侧面板示意图1）调焦旋钮2）粗微调切换按钮3）物镜切换按钮；4）滤光块，DIC检偏器切换按钮5）透射光光源开关（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此按钮无效）；6）透射光量度调节旋钮（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此旋按钮无效）；7）物镜复位；8）物镜向下移动2毫米；注意：在使用显微镜之前，要把主机底座右后端的黑色HUB控制器（显微镜示意图15位置）右侧的电源开关打开。北京大学化学学院中级仪器实验室A1R操作说明书5（二）明视场透射光操作要点1）打开电源开关，并打开显微镜透射光卤素灯电源开关；2）把滤色块移到空位；3）把起偏器，检偏器移出光路；4）把聚光器转盘切换到A状态；5）检查柯勒照明（柯勒照明调节方法参看附录1）；6）检查出光端口。（三）微分干涉(DIC)操作要点1）按照明视场透射光观察方法调节好显微镜；2）把起偏器，检偏器移入光路；3）按照相对应物镜将聚光器镜转盘转到相应N1/N2位置（请参见另外所附对照表）；4）检查出光端口；5）旋转起偏器，选择最佳显示效果。（四）荧光观察操作要点1）打开荧光电源稍待片刻至光源指示灯不闪；（打开约10min稳定，关闭需要超过15min后才可以再次启动）2）确认透射光开关处于关闭状态；3）检查出光端口；4）选择合适的滤色块；5）打开光闸（汞灯面板的shutter旋钮），调节荧光亮度（汞灯面板的ND旋钮），进行观察；6）不观察时，把光闸关掉，以避免荧光淬灭。注意：该系统配置透射和荧光光闸，在做相应操作时，应将对应光闸打开。光闸开关可在遥控器上设定。落射光照明光闸按钮汞灯光闸按钮（电动型号）透射光光闸按钮北京大学化学学院中级仪器实验室A1R操作说明书6显微镜光路调节和照明注意事项（一）柯勒照明的调节方法1）选择10X物镜；2）调焦，使标本清晰成像；3）缩小视场光阑（显微镜视图2位置）；4）上下调节聚光器（显微镜视图3位置），使视场光阑边缘清晰；5）调节聚光器对中旋钮，使其居中；6）放大视场光阑，使其刚刚外切于视野。（二）长寿命汞灯电源的注意事项1）电源打开以后，大约10分钟左右光源达到稳定状态；2）电源关闭以后，至少要等10分钟才能重新打开。（三）物镜盖玻片矫正环的调节方法1）调焦，使图像相对最清楚；2）把矫正环向一个方向转动一定角度，此时图像变模糊，调焦，使图像相对最清楚；3）判断此时的图像质量是否有所改善。如有改善，则按照该方向再旋转一定角度；如质量下降，则反方向旋转；4）重复2）和3）直到图像质量改善之后又有所下降；5）反方向旋转，回到倒数第二次的位置即可。北京大学化学学院中级仪器实验室A1R操作说明书7Ti-E物镜，DIC插片，DIC棱镜对照表Ti-E:CombinationsofobjectiveandDICprismObjectiveDICSliderN1/N2PlanApo10×10×N1PlanApoVC20×20×N2PlanApo40×40×ⅠN2PlanApoVC60×60×IN2PlanApoVC100×100×IN2北京大学化学学院中级仪器实验室A1R操作说明书8第二章共聚焦开关机操作指南（1）Ti-E电动倒置荧光显微镜；（2）A1共聚焦显微镜总控制器；（3）A1共聚焦显微镜光谱探测模块（4）A1共聚焦显微镜标准4通道探测模块；（5）A1共聚焦显微镜扫描头；（6）A1共聚焦显微镜4激光台；（7）A1共聚焦显微镜激光器电源柜；（8）A1共聚焦显微镜透射光探测器；注意：开机时，必须是先打开硬件（包括显微镜，激光器，共聚焦总控制器），再打开NIS-Elements软件；关机时，必须是先关掉软件，再关掉硬件。北京大学化学学院中级仪器实验室A1R操作说明书9（一）A1R-si开机顺序1.打开UPS或接线板总电源开关（一般都处于开机状态）；2.打开需要使用的激光器，不使用的激光器可以不打开（具体见后面）；3.打开共聚焦控制器左侧面板右上角的控制器开关；4.依次打开电脑，显微镜的长寿命汞灯电源，卤素灯电源，电动载物台控制电源；5.打开显微镜底座右后端的HUB控制部件电源；6.待确认控制器打开的状态下，双击桌面NIS-Elements3.0快捷图标，选择NikonA1/C1confocal选项进入软件，开始共聚焦操作。（二）A1R-si关机顺序1.请先确认关闭软件，再关闭共聚焦控制器（此条请特别注意）；2.依次关闭显微镜各个控制部件电源；3.依次关闭各个激光器之后，关闭激光器电源总开关；4.关掉UPS或接线板总开关（遇到如停电等特殊情况时进行此步骤）。（三）激光器的开关机顺序各个激光器的开关是独立的。下面分别加以介绍：首先要打开激光器电源盒前面钥匙旋钮，然后根据需要打开相应的激光器。（1）640nm激光器电源操作面板开机：电源开关拨到ON位置--钥匙开关拨到I位置;关机：钥匙开关拨到O位置--电源开关拨到OFF位置（2）405nm激光器电源操作面板开机：电源开关拨到ON位置--钥匙开关拨到I位置;关机：钥匙开关拨到O位置--电源开关拨到OFF位置（3）488nm多线Ar离子激光器开机：确认开关○5处于Standby位置后，将钥匙开关○6转到on位置，这时风扇开始北京大学化学学院中级仪器实验室A1R操作说明书10转动--大约30秒后，液晶面板会有数字显示17左右--把左侧开关○5由standby拨到operate，液晶面板显示数值40左右，打开完成；关机：把左侧开关由run拨到standby--3a上的钥匙开关转到垂直位置--等几分钟，待风扇停止转动之后，把电源开关拨到OFF位置。（4）543nm激光器（开关内置在激光底座电源中）注意：多线Ar离子激光器功率较高，请务必按照操作步骤开关机，否则会造成该激光器使用寿命的缩短，并有可能导致激光器的损坏。北京大学化学学院中级仪器实验室A1R操作说明书11第三章共聚焦图像拍摄（一）NIS-ElementsC软件开启和操作界面简介1．1打开和关闭CameraSettings窗口当NIS-Elements启动时，CameraSettings窗口自动打开；随着NIS-Elements关闭而自动关闭。1.1.1启动CameraSettings窗口双击NIS-Elements图标。图1.1-1NIS-Elements图标硬件首先进行初始化，桌面上出现[Nowinitializing]对话框。硬件初始化结束后，该对话框自动关闭。图1.1-2Now-Initializing对话框当硬件初始化结束后，弹出NIS-Elements标题窗口；标题窗口自动关闭后，NIS-Elements启动运行。随即CameraSettings自动打开。该窗口也可以通过View菜单下Acquisition栏里找到。图1.1-3标题窗口北京大学化学学院中级仪器实验室A1R操作说明书12图1.1-4初始状态的NIS-Elements窗口和CameraSettings窗口1.1.2关闭CameraSettings窗口NIS-Elements关闭时，CameraSettings也自动关闭。1.2CameraSettings窗口结构CameraSettings是用于设置共聚焦扫描参数的窗体，主要包括：设定激光光源和强度、调整图像亮度、光刺激设定、扫描方法、扫描精度／速度等。图1.2-1CameraSettings窗体北京大学化学学院中级仪器实验室A1R操作说明书13表1.2-1CameraSettings窗体功能列表功能名称功能描述（１）图像获取捕捉实时(live)图像，拍摄图像或应用光刺激设置。此类型的功能均以按钮的形式呈现。（２）扫描模式选择用于共振扫描模式与检流计式扫描模式的切换。当处于实时（live）捕捉状态下时，扫描模式不能更改。在光谱探测（SpectralDetector）模式和虚拟滤色片(VirtualFilter)模式下，只有检流计式扫描模式可用，因此不能改变扫描模式。（３）滤色块和染料用于设置探测通道系列和光路设定。（４）图像获取／光刺激设定图像获取画面用于设定PMT亮度、激光功率和针孔大小。光刺激画面中设置用于刺激的激光的功率。（５）扫描参数设置选取扫描方法、精度、速度等。（６）遥控器选择图标用于标识当前处于遥控器控制下的通道。1.3NIS-Elements的操作界面（1）主菜单栏；（2）上图标工具栏；（3）左图标工具栏；（4）窗口排布选择；（5）控制窗口边栏；（6）图像显示区域；（7）状态栏北京大学化学学院中级仪器实验室A1R操作说明书14上图标工具栏和左图标工具栏图标介绍：Open：打开文件Save：保存当前文件Savenext：将当前文件保存为新文件Print：打印Undo：撤销前一步操作Redo：还原一步撤销的操作LiveFast：快速预览ZStackLive：Z轴序列预览Integrate：叠加，多次拍摄图像累积Average：平均，多次拍摄图像平均RAMBufferON：打开内存拍摄CapturetoRAMBuffer：拍摄存至缓存BackgroudCorrectionON：打开背景校正OpticalConfigurations：打开光路配置设定NewOpticalConfiguration：创建光路配置PointingTool：指针按钮MagnifierGlass：图像放大工具Annotations&Measurement：注释和测量BinaryToolbar：二元蒙板编辑工具Define/RunExperiment：打开多维拍摄窗口CaptureTimeLapse：拍摄时间序列CaptureZSeries：拍摄Z轴序列CaptureMultichannel：拍摄多通道CaptureMultipoint：拍摄多点Copy：复制PasteAsNewImage：粘贴复制图像Crop：剪切RunMacro