西尼罗病毒寡核苷酸基因芯片的初步研究

南方医科大学硕士学位论文西尼罗病毒寡核苷酸基因芯片的初步研究姓名：商涛申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：马文丽;郑文岭20080501西尼罗病毒寡核苷酸基因芯片的初步研究作者：商涛学位授予单位：南方医科大学相似文献(7条)1.会议论文邓永强.陈水平.于曼.姜涛.秦成峰.刘伯华.祝庆余.秦鄂德实时RT-PCR在黄病毒和甲病毒检测中的应用2005目的：建立西尼罗病毒和委内瑞拉马脑炎病毒的快速、敏感、特异的实时RT-PCR法,为这两种病毒所致疾病的早期诊断提供依据.方法：在建立西尼罗病毒和委内瑞拉马脑炎病毒的敏感、特异的实时RT-PCR法的基础上,利用这种方法对这两种病毒感染小鼠的不同组织标本进行了检测.结果：采用所建立的实时RT-PCR法可从西尼罗病毒和委内瑞拉马脑炎病毒感染小鼠的血液、脾脏、肾脏和脑组织标本中检测到不同含量的病毒核酸.结论；本研究建立的实时RT-PCR法具有很高的敏感性和特异性,因此该方法可用于这两类病毒所致疾病的早期诊断和流行病学研究.2.学位论文赵文忠西尼罗病毒检测体系的初步建立2007西尼罗病是由西尼罗病毒引起的人畜共患、虫媒传播的自然疫源性疾病。早在1937年，SmithBurr及其同事从乌干达的西尼罗河地区一个受感染妇女的血液中首先分离到该病毒，命名为西尼罗病毒。西尼罗病并不是一种新发传染病，只是多数感染者为隐性感染或低热等非特异性症状，因此并未引起研究人员的注意。直到20世纪90年代，尤其是1999年在纽约的暴发流行，导致了人群大规模感染和高死亡率，并伴随大量的鸟类、家禽、马和牛等的死亡，才引起全球公共卫生界的关注。虽然我国尚无WND报道，但由于我国存在着WND输入和流行的自然因素和社会因素，需高度警惕，开展WNV监测，防止WND传入，WNV监测方法的建立对保护人群健康，维护社会稳定和经济发展具有重要意义在本研究中，采用RT-PCR扩增WNVC-preM蛋白区基因片段，将其克隆至T载体，测序并进行同源性分析。以阳性质粒为模板，建立Nested-PCR和Real-timePCR检测方法，并进行敏感性和特异性检测。所建立的Nested-PCR法和Real-timePCR法可分别检测到1和10拷贝的西尼罗病毒RNA。而对其他黄病毒科成员的检测均为阴性，表明该方法是特异的。采用RT-PCR方法，扩增WNVE基因D3区，将其克隆至PET32a载体中，构建重组质粒pET-D3，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经1.0mmol/LIPTGG诱导，外源基因以可融性蛋白形式获得高效表达。以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板，建立了检测西尼罗热病毒(WNV)抗体的间接ELISA方法。结果表明，抗原的稀释度为10μg/mL，血清的稀释度为1:100。应用上述两种方法，检测48例发热病人和2例登革病人血清。Nested-PCR法结果全为阴性。ELISA检测48例发热病人全为阴性，2例登革病人血清弱阳性。本研究建立的两种检测方法具有很高的敏感性和特异性，可用于西尼罗病毒疾病的早期监测和流行病学研究。3.学位论文张晓龙蚊-鸟-蚊循环在西尼罗病毒传播中的作用研究2007西尼罗病毒(westNilevirus，WNV)属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(genusFlavivirus)，可导致人类西尼罗热或西尼罗脑炎，该病是由WNV引起，经蚊虫传播，以鸟类为主要宿主动物的自然疫源性疾病。西尼罗病毒在自然界中的传播循环为鸟一蚊一鸟，人和马可作为该病毒的偶然宿主。自1937年首次从乌干达西尼罗地区分离到WNV以来，西尼罗热在非洲、中东和欧亚大陆呈散发流行。然而，上世纪90年代以来，该病的流行趋势发生了重大变化，出现暴发流行的地区增多，尤其1999年在美国纽约首次暴发西尼罗病毒感染，在随后几年内迅速扩散到几乎美国本土所有的州，并到达加拿大、墨西哥、加勒比海地区，表明它不再局限于东半球，而是迅速向西半球蔓延。发病率大幅度增加，且伴随着非常高的鸟类病死率，WNV已成为严重危害公共卫生健康的新发传染病之一。目前，已从至少332种鸟体内检测到WNV感染，包括雀形目(Passeriformes)、雁形目(Anseriformes)、隼形目(Falconiformes)、鸡形目(Galliformes)、鹗形目(Caprimulgiformes)、鹦形目(Psittaciformes)等的种类。其中雀形目有129种鸟感染病毒，鸦科、雀科、森莺科感染病毒鸟种数目较多；另一方面，目前报道有约80余种蚊虫感染西尼罗病毒，其中大部分为库蚊属。我国地域辽阔，有大量的鸟类栖息地和候鸟越冬地，生态环境丰富，具备病毒自然循环所需的宿主、媒介和适宜的生境。由于WNV的媒介种类和动物宿主繁多，而作为扩散宿主的候鸟，具有长途迁徙的习性，存在WNV随候鸟进入我国的途径；此外，染毒家禽、鸟的合法和/或非法贸易增加了WNV输入的可能性；并且，国外研究证实能够感染和传播WNV的蚊虫种类在我国也有广泛的分布，其中国内尖音库蚊复合组主要成员、三带喙库蚊(Cluextritaeniorhynchus)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)和埃及伊蚊(Ae．Aegypti)作为WNV潜在媒介已得到证实，一定程度上增加了中国出现WNV暴发的风险。以往的血清学调查结果表明我国人群和鸟体内有wNV抗体存在，由于同属的JEV在我国长期存在，而JEV和WNV之间存在一定的抗原交叉反应，鸟体内的JEV抗体对WNV感染有无一定的保护作用，值得探讨。本研究通过现场实验研究蚊虫对WNV潜在宿主的嗜血习性、自然界中潜在宿主和媒介携带病毒的检测，并以WNV对经乙脑疫苗免疫的来亨鸡进行攻毒，模拟自然界中存在JEV抗体的鸟对WNV攻毒的敏感性，以此进行WNV潜在媒介、宿主和病毒相互作用的研究并分析其在病毒传播循环中的作用，为制定针对WNV潜在媒介和宿主的有效防控策略提供依据。取得的主要结果如下：1．野外现场动物诱饵对蚊虫的诱集研究在傍山乡镇现场，各种动物组与对照相比较，诱集到的淡色库蚊(Cx．pipienspallens)数量具有显著性差异；家鸡对淡色库蚊的诱集效果较大白鼠、麻雀明显要高(SE均为54.39，T值分别为0.002和0.006)，而家鸽与家鸡对淡色库蚊的诱集效果无统计学意义(SE为54.39，T值为0.057)。多水系农村现场动物诱饵组与对照相比较，诱集到的淡色库蚊数量具有显著性差异，家鸡的诱集效果较大白鼠、家鸽、兔明显要高(F值为997.661，P值为0.000)。同种蚊虫在不同动物厩舍内采集的数量存在显著性差异(F值为6.950，P值为0.000)：淡色库蚊在绵羊圈中最多，而中华按蚊(Anophelessinensis)、三带喙库蚊在奶牛圈中最多；同一动物厩舍采集的不同蚊虫存在显著性差异(F值为17.150，P值为0.000)：奶牛圈中华按蚊、三带喙库蚊最多，猪圈中淡色库蚊、三带喙库蚊最多，鸽舍中淡色库蚊最多，绵羊圈中淡色库蚊最多，鸡圈中淡色库蚊和和三带喙库蚊数量相当。2．野外现场采集的吸血蚊胃血来源分析对现场采集的吸血蚊提取基因组DNA，以PCR扩增分析其胃血来源。淡色库蚊、三带喙库蚊、中华按蚊、凶小库蚊(Cx．modestus)、骚扰阿蚊(Armigeressubalbatus)、白纹伊蚊的胃血均只扩增到哺乳动物细胞色素B基因(Cytb)片段，未扩增到鸟Cytb片段。提示现场采集的吸血蚊只吸到哺乳动物血液，而未吸到鸟类血液。3．野外现场采集蚊虫、野鸟血和鸡血的病毒检测对采自野外现场的蚊虫、野鸟血和鸡血进行的西尼罗病毒、乙脑病毒、西方马脑炎病毒的RT-PCR检测表明：除有2只普通朱雀检测到西尼罗病毒阳性片段外，淡色库蚊、三带喙库蚊、中华按蚊、凶小库蚊、骚扰阿蚊、白纹伊蚊、鸡血样和其余20种野鸟67份血样均未检测到西尼罗病毒阳性片段；所有蚊虫、野鸟血、鸡血样均未检测到乙脑病毒、西方马脑炎病毒的阳性片段。RT-PCR阳性的2只普通朱雀组织中未能检测到西尼罗病毒抗原阳性；西尼罗病毒抗体检测的鸟血样为阴性。检测到的WNV阳性片段序列经同源性比较，提示为WNV核酸片段。对这3个核酸片段的序列分析表明它们与西尼罗病毒Chin-01株同源性最高(97.3％-100％)，与Eg101株、NY99株、Texas株和EnthAn株同源性较高(96％-99％)；支序图表明它们与上述WNV株起源可能相同，起源于Eg101株。4．乙脑疫苗对西尼罗病毒攻毒来亨鸡的保护作用用乙脑疫苗免疫后28天的来亨鸡均可产生乙脑抗体(1：80)，用染毒(WNV)白纹伊蚊叮咬免疫后来亨鸡，32只鸡有7只(21.88％)血液中可检测到WNV阳性片段；经皮下直接接种西尼罗病毒攻毒免疫后来亨鸡，11只鸡中有2只(18.18％)血液可检测到WNV阳性片段，表明人工免疫产生的乙脑抗体来亨鸡可以出现病毒血症，仍有可能被WNV感染。4.会议论文魏荣.王志亮西尼罗病毒的病原学2004西尼罗河病毒分类上属于黄病毒科.在黄病毒科中,本病毒与日本脑炎病毒、墨累河谷脑炎病毒和圣·路易斯脑炎病毒同属于抗原性密切相关的一个病毒群.其所引发的疾病为西尼罗河病毒病,包括西尼罗河热和西尼罗河病毒性脑膜炎脑炎.5.学位论文曾志磊三种嗜神经病毒的核酸检测方法和初步流行病学研究2008目的：本研究拟建立一步法实时RT-PCR检测Nipah病毒(Nipahvirus，NiV)、Hendra病毒(Hendravirus，HeY)和西尼罗病毒(Westnilevirus，WNV)的方法，用于三种嗜神经病毒的快速、准确、敏感、特异的定量检测，为大规模流行病学监测提供一种简便易行的检测手段，并使用所建立的嗜神经病毒检测方法，对采集自中国重庆、四川、贵州和广西地区的猪外周血样本进行NiV和HeV检测，以获得我国西部地区的NiV和HeV的病毒流行病学资料，评估我国西部地区的生物安全现状。方法：1、根据GenBank提供的基因序列，针对三种嗜神经病毒基因的保守区域（NiVN基因、HeVN基因和WNVE基因)，设计并合成特异性引物和荧光标记TaqMan探针。从澳大利亚动物健康实验室(AAHL)及中国军事医学科学院(AMMS)惠赠的分别含有目的基因的质粒出发，利用PCR方法扩增获得目的基因，克隆至pBS-T载体进行体外转录，将得到的RNA纯化并使用RiboGreen方法进行定量后作为阳性标准品。分别建立三种嗜神经病毒的一步法实时RT-PCR方法并分析敏感性和特异性。2、自2007年6月起，采集自中国西部地区重庆、四川、贵州和广西省市饲养的猪外周血标本320份，使用密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞，应用Trizol法提取细胞总RNA。用已建立的NiV和HeV一步法实时RT-PCR检测方法，对RNA样本进行NiV和HeV检测。对阳性样本进行PCR产物序列鉴定、序列分析等研究，在可能的情况下进行病毒分离培养，并提交流行病学调查报告。结果：1、对所设计的NiV和HeV引物和探针序列，登录美国国立卫生研究院网站(http：//)进行Blast检索，所设计的引物和探针可以与所有已公布的NiV病毒株(DQ508095，AF376747，AF212302，AY029768，AY029767，AJ627196，AJ564623，AJ564622，AJ564621，AY858110和AY988601)序列完全匹配。不与Hendra病毒株(AF017149)产生阳性结果。本研究建立NiV和HeV一步法实时RT-PCR方法的最低检出限即敏感性分别为1.7×102copies/μl和2.6×101copies/μl，标准曲线的定量范围分别为1.7×102～1.7×106copies/μl、2.6×101～2.6×107copies/μl，相关系数R2分别为0.9998和0.9896，不与其他病毒发生非特异反应。2、对所设计的WNV引物和探针序列，登录美国国立卫生研究院网站(http：//