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药品质量研究与质量标准-有关物质检查常见问题讨论余立yuliyy8716@vip.sina.com第一次飞跃第二次飞跃纯度控制杂质控制杂质谱控制杂质质控理念的变迁杂质（Impurity）的定义与分类•任何影响药品纯度的物质均称为杂质。•-《中国药典》2010年版附录对药品杂质的定义•原料药中：化学结构和该药品不一样的任何物质•制剂中：除原料药和辅料外的任何其他成分•-ICH对杂质的定义杂质按活性分类杂质活性杂质无活性杂质（无毒无效）毒性杂质（有毒无效）（毒大效低）有效杂质（有效无毒）（高效低毒）杂质按来源分类杂质有关物质（relatedsubstances）无关杂质外源物质杂质来源1有关物质－起始原料－中间体、副产物异构体和聚合物多晶型－降解产物异构体和聚合物多晶型－微生物－污染异物－非法添加物3外源物质2无关杂质－试剂配位体、无机盐、溶剂－重金属催化剂－过滤介质、活性炭已鉴定杂质IdentifiedImpurity特定杂质SpecifiedImpurity潜在杂质PotentialImpurity杂质谱ImpurityProfile已确证了结构特征的杂质在质量标准中规定检查并有自己限度标准的杂质。已鉴定或未鉴定理论推测在生产或贮藏过程中可能产生的杂质实际产品中不一定存在存在于药品中的所有杂质组成或模式新杂质的研究－药物杂质的可能来源1.原料：红霉素A、红霉素B、红霉素C、红霉素D、红霉素E、红霉素F、阿奇霉素B、阿奇霉素C、阿奇霉素E、阿奇霉素F2.中间体：红霉素A肟（Z）、6，9-亚胺醚、氮红霉素A、红霉素A肟（E）、红霉素C肟（E）、9，11-亚胺醚、红霉素C6，9-亚胺醚、红霉素A内酰胺3.副产物：红霉素-N-氧化物、N-去甲基红霉素A、N-去甲基阿奇霉素A、氨基阿奇霉素A、N-甲酰基-N去甲基阿奇霉素A、N-去甲基-N-苯磺酰基阿奇霉素、阿奇霉素N-氧化物、3’-去（二甲氨基）-3’,4’-去氢阿奇霉素、O-甲苯磺酰基红霉素肟、红霉素Z肟重排物、氮红霉素11，12-硼酸酯、N，N-去二甲基N-甲酰基阿奇霉素A、丙基阿奇霉素、3’-N，N-去二甲基氨基-酮基阿奇霉素A、阿奇霉素11，12-硼酸酯4.降解产物：去克拉克定糖阿奇霉素A、去克拉克定糖氮红霉素、红霉素8，9-脱水-6，9-半缩酮、红霉素6，9：9，12-螺缩酮阿奇霉素中可能存在的杂质：37种•附录ⅩⅨF药品杂质分析指导原则•附录ⅩⅨA药品质量标准分析方法验证指导原则2010年版药典中的杂质分析•Q3A－新原料药中的杂质•Q3B－新制剂中的杂质ICH中的杂质分析其他参考资料•《化学药物杂质研究的技术指导原则》•《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》有关物质检查的常用方法适用多种杂质（定性＋定量）主要用于没有紫外吸收的杂质（定性＋半定量）适用不同的特定杂质（定性＋定量）TLCHPLC其他方法有关物质检查的其他方法容量滴定原子吸收重量法比色比浊物理常数紫外其他方法•物理常数测定法•旋光度-检查具有光学活性的杂质•紫外分光光度法•杂质吸光度-在特定波长具有紫外吸收的杂质•容量滴定法•游离脂肪酸、过氧化物、还原糖•重量法•酸中不溶物、水中可溶物•比色比浊法•游离淀粉、碘化物、铁盐等；氯化物、硫酸盐有关物质检查的其他方法有关物质检查的其他方法•原子吸收分光光度法：检查金属杂质•毛细管电泳法：抑肽酶中检查去丙氨酸-去甘氨酸-抑•肽酶和去丙氨酸-抑肽酶两个特定杂质•气相色谱法：检查挥发性杂质•热分析法：检查不同晶型的杂质•拉曼光谱法、红外光谱法、X-射线粉末衍射•生物检定法、酶联免疫试剂盒（抗生素残留量）有关物质检查的其他方法有关物质检查的其他方法HPLC方法的建立与验证•高效液相色谱法系用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。二极管阵列蒸发光散射示差折光电化学质谱荧光紫外检测器的种类HPLC方法的建立溶液浓度检测波长色谱柱系统适应性试验方法新方法分析方法的有效性（氨苄西林钠/舒巴坦钠）原方法中国抗生素杂志，2009，34：734在对已有方法比较的基础上确定最佳分析方法典型的HPLC方法测定有关物质有关物质照高效液相色谱法（附录ⅤD）测定。•色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液（pH6.3）［取磷酸二氢钾9.07g，加水1000ml使溶解，用无水磷酸氢二钠溶液（9.46g→1000ml）调节pH值至6.3，临用前稀释10倍］-乙腈-甲醇（36：11：3）为流动相，流速每分钟1.5ml；检测波长为200nm；柱温40℃。分别取前列地尔对照品溶液、前列腺素A1和前列腺素B1杂质对照品溶液各适量，按（1：1：1）比例混合，摇匀，作为系统适用性试验用溶液。取该溶液25μl注入液相色谱仪，调节色谱系统，使前列地尔峰的保留时间约为11～13分钟，前列腺素A1峰与前列腺素B1峰的分离度应符合要求；同时调节检测灵敏度，使前列腺素B1峰的高度约为满量程的10%。•••测定法精密称取本品适量，用乙腈-水（9：1）溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液作为供试品溶液；精密量取含量测定项下的对照品溶液适量，用乙腈-水（9：1）稀释制成每1ml中约含10μg的溶液，作为前列地尔对照品溶液；另精密称取前列腺素A1和前列腺素B1杂质对照品各适量，用乙腈-水（9：1）分别溶解并定量稀释制成每1ml中约含15μg和5μg的溶液作为前列腺素A1和前列腺素B1的杂质对照品溶液。精密量取供试品溶液、前列腺素A1、前列腺素B1杂质对照品溶液和前列地尔对照品溶液各25μl,分别注入液相色谱仪，记录供试品溶液的色谱图至主成分峰保留时间的4倍。前列腺素A1和前列腺素B1均按外标法计算，分别不得过1.5%和0.5%；其他杂质按主成分自身对照法计算，单个最大杂质的峰面积不得过前列地尔对照品溶液的主峰面积（1.0%）；杂质总量不得过2.0%（小于0.01%的色谱峰不计）。•HPLC方法的建立与验证•溶剂的选择：溶液稳定性考察•-溶解度高且稳定•＞8小时不需提示•＜4小时提示临用现配或立即进样•＜2小时改换溶剂-无背景干扰或小溶剂峰、倒峰-低毒价廉•检测波长的选择检测波长的选择主波长、低波长、杂质波长、权衡波长••检出杂质的数与量•干扰因素•操作的便捷性检测波长的选择色谱柱的选择•反相色谱系统使用非极性填充剂•C18、C8；氰基柱、氨基柱•正相色谱系统使用极性填充剂•硅胶柱•离子交换填充剂；•凝胶或高分子多孔微球；•手性键合填充剂色谱柱的选择-常见问题•色谱柱与流动相性质不匹配•100%的水或Buffer最好选水相柱（AQ柱）•普通C18柱流动相中用到离子对试剂，用后应好好冲•最好专用！•因色谱柱填料性质已与原来有所不同•在该柱上所摸索的色谱条件，可能在其它同类柱子上得不到重现！•流动相的选择•-分离能力强•（各种有关物质基本分离）•-温和稳定•（pH、比例适中对柱伤害小，性质稳定）•-配制简单、易得价廉•-无毒环保•头孢曲松钠的流动相原来0.8%四庚基溴化铵乙腈溶液-水-磷酸盐缓冲液-枸橼酸缓冲液（500：440：55：5），由4种成分组成，需配制3种缓冲液；•后改为0.02mol/L正辛胺溶液-乙腈（73：27），用磷酸调节pH值为6.5，仅由2种成分组成流动相的选择分离能力的考察-粗产品溶液或配制各种杂质混合物（起始原料，中间体，副产物）-强制降解•（酸、碱、光、热、氧化）二、HPLC方法的建立与验证•强制降解的考察方法误区：•（酸、碱、光、热、氧化）-破坏条件过于强烈（控制在主成分降低10%~20%为宜）-中和方法-目的不明确，结论不正确分离能力的考察二、HPLC方法的建立与验证•-不规定柱温•（不需加温且对温度不敏感）-25℃或30℃（不需加温但对温度敏感，需保持恒温）-35℃～70℃•（需加温且对温度敏感，需保持恒温）•作为耐用性试验之一•且可与溶液稳定性同时进行柱温的确定溶液的配制•需要注意的几点：•-需否避光？•-可否超声、加热、多久？过滤？滤材？-浓度与线性范围和检测限是否匹配？•弃20ml初滤液？用xx膜过滤？•用聚四氟酰胺小瓶？•机械振摇xx分钟等等？二、HPLC方法的建立与验证•-常用10μl～100μl•-过低误差大，影响重现性•-太多过载，影响峰形与分离-配合溶液浓度保证检测灵敏度进样体积的确定色谱系统的适用性试验•-指标的应用•-分离度的保证•-灵敏度的测试-精密度的要求系统适用性试验要求重复性理论板数分离度保留时间拖尾因子常用指标分离度指标性物质的选择•-难分离物质对•-最常出现的杂质•-单独规定限度的特定杂质-结构性质相近且不干扰测定的物质二、HPLC方法的建立与验证•-准确定量分析时通常两峰间R≥1.5•-峰高峰谷比分离度的要求拖尾因子（T）的要求与应用•为保证分离效果和测量精度用于评价色谱峰对称性•的指标T=W0.05h/2d1•式中W0.05h为5％峰高处的峰宽；•d1为5％峰高出峰顶点至峰前沿•之间的距离•除另有规定外，峰高法定量时•T应在0.95～1.05之间。•峰面积法测定时，若拖尾严重，将•影响峰面积的准确测量。峰前峰后有•紧邻杂质峰时，对拖尾因子作出规定。重复性（RSD）的要求•用于评价连续进样后，色谱系统响应值的重复性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%；采用内标法时，通常配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于2.0%•在质量标准中如果没有明确规定，就是≤2.0%特定杂质峰定位的方法杂质对照品混合对照品临时降解相对保留时间+参考图峰定位方法的验证•验证定量限度•-准确度+-•-精密度+-•重复性+-•中间精密度（+）-•-专属性++•-检测限（+）+•-定量限+--线性范围+--耐用性++定位方便定量准确要求严费用高70%有条件时首选的方法主成分自身对照法优点缺点50%不需定位费用低定量粗70%没条件时首选的方法加校正因子的主成分自身对照法优点缺点50%定位方便定量较准确需测定因子定位难70%杂质与主成分响应因子差异大（超过0.9~1.1）且对照品昂贵时选用的方法面积归一化法优点缺点50%不需定位费用低定量粗70%不提倡使用的方法影响多重复性差根据生产现状杂质限度的规定•毒性杂质严控：•-遵守公认标准-不超越前期标准-以相关安全实验数据为科学依据-以保证临床安全为根本目的杂质限度的规定•有效杂质宽管：•-不能不管（三磷酸腺苷二钠、头孢拉定）-不超越前期标准-以投入产出比等利弊平衡为科学依据杂质限度的规定•非特定杂质：•-不超越前期标准•-一般不得过0.10%（2010年版）-以安全实验和投入产出比等利弊平衡为科学依据辅料影响的排除-有关物质检查•前沿色谱峰，易排除•少峰，可定位，能排除•多峰，难定位，不能排除辅料对测定的干扰辅料对测定的干扰1、避免使用（辅料或方法）2、不排除可以（默认或校正）3、排除辅料干扰方法要明确、易重现、具可操作性、配混合液4、保证特定杂质（最具代表性降解产物）检出效果-不得已的最后一招比较研究的标尺问题-购买的对照品/标准品对照品/标准品权威性真实性准确性-发票、标签、批号、分析报告单、盐基/碱基、水分•详细精制方法、质