第4章第2讲免疫学检测技术及在食品中的应用

第4章第2讲免疫学检测技术及在食品安全中的应用荧光免疫技术放射免疫技术酶免疫技术免疫胶体金技术利用免疫学技术可以检测细菌、真菌、病毒、寄生虫、各种毒素、蛋白还可检测激素、药物残留、抗生素及其他生理活性物质1酶免疫技术——ELISA检测技术ELISA全称：酶联免疫吸附测定（enzyme-linkedimmunosorbentassay）将抗原抗体的特异性与酶反应的敏感性相结合，使得食品在未经分离提取的前提下，即能进行定性或定量检测广泛用于细菌、真菌、病毒、寄生虫、各种毒素等大分子蛋白，以及激素、农兽药残留、抗生素能小分子物质的检测可检测标本类型广泛体液：血清、血浆、胸腹水、灌洗液、脑脊液分泌物：唾液排泄物：尿液、粪便等细胞培养上清组织匀浆1.1ELISA的发展历程免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的一大新型的血清学技术。1966年，Nakane和Avrameas等分别报道用酶代替荧光素标记抗体，建立了酶标抗体技术用于生物组织中抗原的定位和鉴定。1971年，Engvall，VanWeemen等报道了酶联免疫吸附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技术目前，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。ELISA板酶标仪测吸光度ELISA是一种免疫测定技术：基于抗原抗体反应酶联：抗原或抗体的酶标记吸附：抗原或抗体的固相化测定：加入酶反应的底物后，被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，采用酶标仪进行测定1.2解释：酶联免疫吸附测定间接法夹心法竞争法捕获法1.3类型酶抗抗体酶标记抗抗体抗体抗原固相载体1.将抗原包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗抗体，则结合为抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物。4.酶催化底物并显色。（1）间接法间接法——测抗体洗涤洗涤洗涤待测抗体酶标抗抗体病原体抗体的检测而进行传染病的诊断（2）双抗体夹心法固相载体抗体抗原酶抗体酶标记抗体1.将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗体，则结合为抗体-抗原-酶标记抗体复合物。4.酶催化底物并显色。夹心法——测抗原洗涤洗涤洗涤待测抗原在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等产品举例氟苯尼考（FF）ELISA快速检测试剂盒（GreenSpring）可用于动物组织（肌肉、肝脏）、尿液、血清、蜂蜜、肠衣、牛奶以及水产品等样品中氟苯尼考药物残留的检测。人金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)ELISA检测试剂盒（3）酶标抗原竞争法固相载体抗体抗原酶酶标记抗原1.将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则优先竞争结合抗体，结合为抗原抗体复合物。3.同时加入酶标记抗原，抗原没有结合的位点酶标记抗原去占据，则结合为酶标记抗原-抗体复合物。4.酶催化底物并显色。抗原竞争法——测小分子抗原洗涤洗涤待测抗原酶标抗原小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。4捕获法示意图酶抗体酶标记抗体抗原抗抗体固相载体抗体1.将抗抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗抗体-抗体复合物。3.加入抗原及酶标记抗体，则结合为抗抗体-抗体-抗原-酶标记抗体复合物。4.酶催化底物并显色。固相抗IgM特异IgM非特异IgM标本特异抗原抗原特异酶标抗体底物此法常用于病毒性感染的早期诊断。捕获法1.4操作流程将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包被(coating)。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。（1）包被包被的条件pH9.6碳酸盐缓冲液pH7.2的磷酸盐缓冲液pH7-8的Tris-HCL缓冲液。加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。（2）封闭封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。所有的ELISA固相均需封闭。（3）加样在ELISA中一般有3次加样步聚即加样本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。（4）保温抗原抗体完成反应的保温过程称为温育应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。（5）洗涤洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。(6)显色显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。酶在ELISA中，可以采用的有HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP（辣根过氧化物酶）是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。底物HRP的底物DH2+H2O2D+2H2ODH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)等。OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。1.5ELISA影响因素固相载体：ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板。抗原：可溶性、优质、稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。试验样品：血清、血浆或其他体液，均可作为ELISA的试验样品。结合物：酶结合物要求稳定，具有很高的酶活性，抗原或抗体的特异性，产量高及成本低。底物：各种酶都有对底物的特异性，不同种类的酶要求有不同的底物。作用时间：加底物后终止时间？结果判断:ELISA的试验结果可用肉眼观察颜色反应的深浅作出判断，也可用分光光度计作精确测定。试验的重复性（精确度）：通常用变异系数来表示。思考：如何研发商品化的ELISA试剂盒？需要什么原料，得到哪些组分，摸清哪些条件，才能够进行组装？2免疫胶体金技术（胶体金试纸条检测技术、胶体金层析）大肠杆菌O157:H7快速检测试纸（胶体金）2.1简介胶体金试纸条诊断是采用胶体金免疫层析技术研制而成，该技术是90年代初在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，最先用于人绒毛膜促性腺激素（HCG）的测定和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）等检测。胶体金（Colloidalgold）是氯金酸（HAuCl4）的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。故称胶体金用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒质量好的胶体金：溶液呈红色，胶体金颗粒为球形，大小均一，无棱角。质量差的胶体金：溶液呈紫色，大小不一，形状各异。胶体金的质量判定标准胶体金标记的原理：胶体金在碱性条件下带负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团静电吸引而形成牢固结合。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中2.2胶体金试纸条诊断技术的原理以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色（红色）反应，检测抗原/抗体。检测线质控线吸收垫样品垫硝酸纤维素膜胶体金垫背衬（底板）胶体金试纸条示意图2.3分类间接法----测抗体双抗夹心法----测大分子抗原----食品中沙门氏菌的检测竞争法----测小分子抗原----食品中瘦肉精、黄曲霉毒素的检测沙门氏菌单克隆抗体可能含有沙门氏菌的样品（1）双抗夹心法检测抗原——测大分子抗原沙门氏菌多克隆抗体抗抗体（2）思考竞争法的原理？检测线喷的是纯化的抗原，与待检测抗原竞争这种情况下的结果判定？2.4胶体金快速诊断技术的特点简捷快速：操作简单，一般只要5-10min就会出结果，而其它方法如ELISA需要1-2h，PCR需要时间更长。结果易于判定：阴、阳性呈色很明显，肉眼很容易判断。特异性好：因为该技术大多用单克隆抗体标记，这决定了它具有很好的特异性。2.5技术分项•样品垫•吸水垫•粘性底板•NC膜•胶体金垫•干燥方法•抗原抗体生物原料•胶体金制备•标记技术•溶液喷点•溶液体系分析•装配\切条\包装（1）金标垫与样品垫的处理1，金标垫裁剪成长10㎝，宽8㎜长条2，样品垫裁剪成长30㎝，宽2.5㎝长条3，将裁剪好的金标垫与样品垫，分别用金标垫处理液与样品垫处理液浸润，放入37℃温箱中烘干储存在干燥器中置4℃冷库中备用。抗体Antibody•来源差异:鼠抗,兔抗和羊抗•种类差异:单抗,多抗•腹水的处理:饱和硫酸铵沉淀法•特异性:亲和层析柱•浓度:浓缩•溶解液:不含盐,例如PB（2）抗原抗体生物原料抗原Antigen•偶联抗原物质:BSA,OVA等•毒品检测来源:合成抗原（3）标记技术Conjugate•容器硅化处理•金颗粒制备(负电)•颜色与颗粒的关系.最佳标记颗粒大小40nm.•蛋白质最适用量测定:盐析法（4）胶体金制作流程1，向硅化过的三角瓶中加入100ml去离子水，再加入1ml浓度为1%的氯金酸2,将三角瓶放入微波炉中加热，沸腾时取出，一次性迅速加入1850μl浓度1%柠檬酸三钠，摇动约20s（柠檬酸三钠经0.22滤膜过滤）3,再将三角瓶放入微波炉中大火1分钟，调中火继续加热五分钟。4，拿出来冷却，待温度降至室温时用去离子水补足到100ml,用0.1M的碳酸钾调节PH至略高于待标记蛋白的等电点，0.22过滤转移至硅化过的平底蓝盖瓶中。5，蓝盖瓶中放入搅拌子，搅拌，向金溶液中加入蛋白,标记量为2μg/ml，缓慢加入标记蛋白。6,搅拌,半小时后加入浓度为10%的BSA至终浓度为0.2%，继续搅拌一小时。7，将标记好的溶液转至50ml离心管中，3500rpm/min，4℃离心30min.弃去沉淀，收集上清。8，上清转入另外的50ml离心管中，7500rpm/min，4℃离心30min,弃上清收集沉淀。9，用1/2原体积的洗涤液洗涤沉淀，7500rpm/min，4℃离心30min,弃上清收集沉淀。10，用十分之一原体积的重悬缓冲液重悬沉淀。11，重悬后的胶体金转入硅化过的蓝盖瓶。（5）溶液喷点---喷点溶液Dispensing(BIODOTXYZ系列喷点仪器)C\T线溶液前处理:1.过滤,0.2um孔径滤膜2.离心1万转10分钟喷点过程头尾去除,喷点中的报废标志C\T线喷点工艺(BJQ3000喷头)与接触划点(FL1000XY喷头)工艺比较（6）装配\切条\包装Lamination装配切条(演示:BIODOTCM4000切条机)刀的维护与清洁底板选择(胶的影响)包装（7）灵敏度问题源头:抗原抗体免疫