微生物检测技术--金黄色葡萄球菌检测

食品的微生物学检验致病菌主要内容金黄色葡萄球菌（GB4789.10-2010）大肠杆菌（GB4789.38-2012）沙门氏菌（GB4789.4—2010）副溶血性弧菌（GB4789.7—2013）金黄色葡萄球菌检验p1531、生物学特性（重点）2、致病性3、流行病学4、国标检验方法（重点）5、快速检测方法1、生物学特性1.1形态与染色金黄色葡萄球菌无芽孢，无鞭毛，大多数无荚膜革兰氏染色阳性；典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。1.2培养特征易培养，对营养要求不高，在普通培养基中生长良好。需氧或兼性厌氧，在好氧条件下生长最好；大多数菌株能生长在6.5-46℃之间（最适温度30-37℃）能在pH4.2-9.3之间生长（最适pH为6-7）；耐盐性强，在含7～15%的氯化钠培养基中仍能生长，可用于筛选菌种。在普通营养琼脂平板上培养18～24ｈ，可形成圆形、表面光滑、不透明的菌落。可产生金黄色色素，色素为脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落内，不渗至培养中。溶血：红细胞破裂，血红蛋白逸出称红细胞溶解，简称溶血。溶血素是细菌分泌的一种毒性因子血平板：可形成完全透明溶血环（溶血）细菌的溶血现象根据细菌对红细胞的溶解能力可分为以下三种溶血类型及现象：α溶血:产生溶血素，不完全性溶血，在血琼脂平皿上菌落周围有1～2mm，较窄半透明的草绿色溶血环。β溶血:呈完全性溶血，在血平皿上菌落周围有2～4mm宽、界限分明、无色透明的溶血环。γ溶血:不产生溶血素，在血琼脂平皿上的菌落周围无溶血环。可产生卵磷脂酶，在卵黄高盐培养基上形成周围有白色沉淀环的菌落。1.3生化反应大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。分解甘露醇，产酸。2、致病性金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，为条件致病菌。可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。葡萄球菌皮肤感染菌株致病力的强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：a.溶血素：外毒素，分α、β、γ多种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E五种。2、致病性++++当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可相当数量的肠毒素。肠毒素可耐受100度煮沸30min而不被破坏。人摄食该污染产品后2-3h便可出现中毒症状。其引起的食物中毒典型症状为呕吐和腹泻。3、流行病学在自然界中广泛存在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。金黄色葡萄球菌的流行病学近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。++++金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。金黄色葡萄球菌的流行病学4、GB4789.10—2010食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验1范围本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的检验方法。本标准第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验；第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数；第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。检验前准备工作采集与送检预处理菌落总数大肠菌群致病菌纯化分离培养前增菌多项鉴定及检测实验分析、报告食品微生物检验的一般程序检测步骤---增菌利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性（可耐受15%的氯化钠），用含7.5%氯化钠肉汤蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g氯化钠75g蒸馏水1000mL检测步骤---增菌或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤（污染严重时）胰酪胨（或胰蛋白胨）17.0g植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）3.0g氯化钠100.0g磷酸氢二钾2.5g丙酮酸钠10.0g葡萄糖2.5g蒸馏水1000mL检测步骤---分离血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血平板上产生明显的溶血环。血平板上其典型菌落呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血圈。血平板Baird－Parker琼脂平板(BP平板)胰蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g酵母膏1.0g丙酮酸钠10.0g甘氨酸12.0g氯化锂5.0g琼脂20.0g蒸馏水950mL卵黄亚碲酸钾增菌剂50mL检测步骤---分离检测步骤---分离BP平板：胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、维生素和痕量矿物元素丙酮酸钠、甘氨酸和氯化锂是一种生长促进剂亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有毒性，并使菌落产生黑色卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环检测步骤---分离在BP平板上其典型菌落为：圆形，光滑突起，湿润，直径2-3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘常为淡色（米黄色或灰白色略带灰色或黄色的白色），周围为一混浊带(沉淀环)，在其外缘常有一透明圈。用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感。B-P平板检测步骤---鉴定染色镜检金黄色葡萄球菌可以产生凝固酶，使血浆中纤维蛋白原转变为纤维蛋白，附着于细菌表面，产生凝固。因此对其鉴别的主要实验是测定其凝固酶。血浆凝固酶试验：吸取1:4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，置36±1℃温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固,即将试管倒置或倾斜时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。结果报告如血浆凝固酶试验阳性，可判定为金黄色葡萄球菌。报告在25g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。36℃±1℃18h～24hGB4789.10-2010第一法BHI肉汤和营养琼脂小斜面血浆凝固酶试验检样:25g(mL)样品+225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤，均质Baird-Parker平板,血平板涂片染色观察溶血报告结果36℃±1℃18h～24h增菌分离鉴定1．关于金黄色葡萄球菌,下列哪种说法是错误的——————A.耐盐性强B.革兰阳性菌C.在血琼脂平板上形成完全透明的溶血环D.分解葡萄糖产酸产气2．以下属于金黄色葡萄球菌的特点有——————A.血浆凝固酶试验阳性B.产生溶血素C.分解甘露醇D.产生耐热核酸酶3．金黄色葡萄球菌的培养特性是——————A.营养要求高，必须在血平板上才能生长B.均能产生金黄色色素C.耐盐性强,可在含7%～15%NaCL的培养基中生长D.专性需氧课堂练习4．金黄色葡萄球菌定性试验中所用的增菌液是()。A7.5%氯化钠肉汤B10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤C蛋白胨水D.PDA5．金黄色葡萄球菌在BP平板中的典型菌落特征有——————A.颜色呈灰色到黑玉色B.有混浊带C.常有一透明圈D.较干燥课堂练习