PCT胶体金试纸制备及其原理

2020/2/14PCT胶体金试纸制备及其原理程骏2016年6月3号2020/2/14•胶体金的概念•胶体金的特性•免疫胶体金技术介绍•PCT相关介绍•PCT胶体金试纸制备•其它2020/2/14一、胶体金的概念胶体金（colloidalgold）也称金溶胶（goldsolution）：是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12－），外层双层正离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。2020/2/14二、胶体金的特性1、胶体性质金颗粒直径多在1～100nm，稳定、均匀、呈单一分散的状态悬浮在溶液中；胶体金对电解质的敏感性，易使胶体金的稳定状态被破坏，使单一分散的胶体金颗粒聚集成大颗粒，从溶液中沉淀下来。某些蛋白质等大分子物质具有保护胶体金、增强胶体金稳定性的作用。2020/2/142、呈色性微小颗粒胶体呈红色，但不同大小的胶体呈色有一定的差别。最小的胶体金（2～5nm）是橙黄色的，中等大小的胶体金（10～20nm）是酒红色的，较大颗粒的胶体金（30～80nm）则是紫红色的2020/2/143、光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，这个光吸收峰的波长（λmax）在510～550nm范围内，随胶体金颗粒大小而变化，大颗粒胶体金的λmax偏向长波长，反之，小颗粒胶体金的λmax则偏于短波长。胶体金的这一特性被用来检测所配制的胶体金溶液是否符合生产所需。实验生产需要的合格的胶体金溶液的最大吸收波长应在522~528nm处，且检测最大吸光度处吸光值与456nm处吸光度值的比值，应在1.6-1.8之间。胶体金粒径（nm）1%柠檬酸三钠加入量（ml）胶体金特性呈色λmax162.00橙色51824.51.50橙红522411.00红色52571.50.70紫色5352020/2/14三、免疫胶体金技术介绍1、免疫胶体金技术简介免疫胶体金技术(Immunecolloidalgoldtechnique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，英文缩写为：GICT。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。2020/2/142、免疫胶体金原理免疫金标记技术(Immunogoldlabellingtechique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。2020/2/143、常用的免疫胶体金检测技术（1）免疫胶体金光镜染色法（2）斑点免疫金渗滤法（3）胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。2020/2/14四、PCT相关介绍1、PCT简介PCT（降钙素原，procalcitonin）是一种蛋白质，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高。自身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高。局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症不会导致其升高。细菌内毒素在诱导过程中担任了至关重要的作用。血清降钙素(CT)的前肽物质分子量：14.5kDa由116个氨基酸组成的糖蛋白质无激素活性2020/2/142、PCT的指征PCT是诊断和监测细菌炎性疾病感染的一个参数。PCT的测定可以预示为：作为一个急性的参数来鉴别诊断细菌性和非细菌性感染和炎症。监测有感染危险的患者（如外科术后和器官移植后免疫抑制期，多处创伤后）以及需要重症监护患者，用来探测细菌感染的全身影响或检测脓毒性并发症。2020/2/14在细菌感染/脓毒血症状态下，PCT在各个组织、器官大量形成并释放进入血液循环系统正常情况CT降钙素脓毒血症及促炎症细胞因子PCT降钙素原2020/2/14脓毒症诊断的生物标志物AnInformalCategorizationofBiomarkersofSepsisMarkerDiagnosisPrognosisMonitoringProcalcitoninInterleukin6WhitecellcountEndotoxinC-reactiveproteinHLA-DRProteinCIL-10HMG-1+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++无论是对脓毒症的诊断、预后评估及治疗监测，PCT都体现出最优异的性能2020/2/143、PCT在临床中的意义PCT反应疾病的严重程度随着疾病的进展水平持续升高在感染疾病严重程度的发展过程中，PCT随着严重程度的不同（局部感染、脓毒血症、严重脓毒血症、脓毒性休克），呈现由低到高的浓度变化。2020/2/14五、PCT胶体金试纸制备1、胶体金制备原理（氯金酸法）氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。HAuCl4还原剂Au原子2020/2/14试剂和浓度还原剂形成胶体金的大小1%氯金酸水溶液白磷的二乙醚溶液5nm颗粒，红色溶胶1%氯金酸水溶液抗坏血酸水溶液12nm颗粒，红色溶胶1%氯金酸水溶液柠檬酸三钠水溶液15~150nm颗粒，红色溶胶不同还原剂产生的胶体金这里主要谈谈制备20~40nm金颗粒，因为这种大小的金粒最适于快速诊断测试使用。2020/2/14配置样品垫处理液配置金标垫处理液配置胶体金粘膜配置划膜液样品垫处理切割喷金内包大卡组装金标垫处理标记抗体划膜外包入库现场抽检取样送检2020/2/142、配液前的准备工作以及注意事项（1）由于氯金酸对金属的强腐蚀性，因此，一切接触氯金酸的物体都应该为非金属材质。包括：称量匙，以及配置胶体金时，磁力搅拌器上的温度传感器，以及ph计上的温度传感器。（2）所使用的玻璃器皿必须是清洗干净，并且经过重铬酸钾和硫酸浸泡过的。浸泡前用超纯水清洗干净，用毛刷刷干净，干燥后用重铬酸钾和硫酸溶液浸泡24小时以上，用清水冲洗3-4次，干燥待用。此种方法可以不需要硅化处理。如若玻璃器皿不干净（有其他金属离子存在或者灰尘）都将会影响金颗粒的形成，以及大小不均匀或者浑浊。2020/2/14（3）由于氯金酸的对光敏感性，因此配制胶体金的整个过程都需要避光，或者弱光，避免使用日光灯等照明设施。氯金酸长时间储存在光下容易变成黑色，影响结果的观察。（4）氯金酸吸湿性极强，因此综合考虑，为了减少称量误差等因素，称量时，天平室将抽湿机打开，使空气湿度降至30％左右，同时采取减量法称量。一般情况下，拆开后尽量一次配置完。（5）配制好的1％的氯金酸溶液储存在4℃冰箱里，黑色塑料袋封住避光。2020/2/143、PCT胶体金试纸样品垫处理液配置Borax4.44gCasein0.233gPvP-102.33g胆酸1.167gS-164.66gEDTA0.7g先用30%k2CO3溶液将PH调节到9.0然后定容至233.3ml4℃保存，有效期两年注：Borax硼酸，Casein酪蛋白，PvP-10聚乙烯吡咯烷酮，S-16惰性蛋白，EDTA乙二胺四乙酸先将水加热至60℃左右，依次加入S-16，搅拌溶解，冷却至室温，加入Borax、PvP-10和胆酸，因为Casein和EDTA不是很稳定，需要最后加入。在未加入k2CO3碳酸钾调节PH前会有一些沉淀不溶解，PH升高后会溶解，不需要奇怪。2020/2/144、PCT胶体金试纸金标垫处理液配置Na2HPO48.83gBSA6.25gTriton-x1001.25gPVA6.25g先用1M的HCL调节PH至7.4然后加纯水定容至1250ml4℃保存，有效期两年注：BSA牛血清白蛋白，Triton-x100聚乙二醇辛基苯基醚，PVA聚乙烯醇先将水加热至60℃左右，加入Na2HPO4和PVA，冷却至室温，最后加入BSA和Triton-x100，搅拌溶解。2020/2/145、PCT胶体金试纸样品垫和金标垫处理样品垫和金标垫的处理方式一样，都是将切割好的样品垫（玻纤膜-有些脆，需小心）和金标垫（聚酯膜）浸泡在处理液中1小时，使其彻底湿润。（半小时需用镊子翻一次面）然后将浸泡好的膜放入烘干机内37℃烘干20小时（此时要记录浸泡的膜的张数，处理液的剩余量，干燥室内的温度和湿度），烘干后取出膜放入装有干燥剂的铝箔袋内备用，整个过程要在烘干箱内完成。2020/2/146、配置胶体金准备的试剂：1%氯金酸，1%柠檬酸三钠（现配现用），超纯水步骤：1、取100ml超纯水于磁力搅拌器上加热至80-90℃；2、加入2ml氯金酸溶液继续加热至沸腾（保持沸腾10s）（注意：当氯金酸溶液加入后不可以再用金属温度传感器，以防止损坏传感器，污染溶液）；3、快速加入（取1%柠檬酸三钠溶液3ml，超纯水定容到10ml）上述烧瓶中，同时搅拌迅速，使其充分接触反应，继续加热，直至溶液沸腾，将加热温度降至105-110℃（待确认）保持沸腾反应10min；4、停止加热，将烧瓶移至避光处，自然冷却至室温。（注意：整个过程都是避光的）2020/2/145、检测1：待胶体金溶液冷却至室温，肉眼观察胶体金溶液的颜色是不是酒红色，是否澄清，无漂浮物或者沉淀。检测2：用分光光度计检测吸光度：检测最大吸光度值是否在525nm附近，方法是可以用光谱扫描法找到最大吸光度值波长，也可以用多波长测量法检测525nm及其附近波长的吸光度，比较大小。最大吸光度值在525nm+3nm处为合格.检测3：检测最大吸光度处吸光值与456nm处吸光度值的比值，是否在1.6-1.8之间。2020/2/14影响胶体金稳定的因素：1、操作环境和所用容器的清洁度2、配制溶液所用的水（均需使用双蒸水或三蒸去离子水配制，烧制胶体金最好用去离子水）3、还原剂的使用量4、不同的烧制方法5、胶体金的制备量6、还原剂的加入方式7、加热容器的大小8、加热的时间2020/2/147、标记胶体金1.取检验合格的胶体金溶液100ml,用碳酸钾（0.2mol）调节PH至7.2-7.4（大约400ul）（先用试纸测量，再用酸度计测量）室温搅拌15min；2.加入1mgPCT鼠抗人单抗（使抗体终浓度为10ug/ml）,室温搅拌30min；3.加入2ml10%BSA封闭抗体,室温搅拌30min；4.装入2罐离心管，8℃12000rpm离心20min；5.弃上清液，留沉淀。2020/2/14蛋白通常带有多种电荷，当蛋白带正