药物中残留溶剂的检测研究_

76综述药物中残留有机溶剂检测研究进展药物中的残留溶剂是指在原料药、辅料以及制剂过程中产生或使用，在工艺中难以除尽的有机挥发性化合物。残留溶剂能改变某些药物晶形[1]、增大药物吸潮作用[2]，影响药物质量，尤其是今年来残留溶剂的毒性及致癌作用日益引起医药管理部门重视，因此药物中残留溶剂应尽量除去，并对其进行限量控制。人用药物注册技术要求国际协调会议（ICH）制定了药物中溶剂残留量控制的指导原则（ICHQ3C），目前已经被大多数国家接受和采用。1政策与法规2007年昀新美国药典（USP30-NF25）[3]及英国药典（BP2007）[4]相继出版，其附录中药物有机溶剂检测项比昀新版中国药典（2005年版）[5]仍有一定区别。1.1有机溶剂残留量测定对象以及限度本部分参照USP30-NF25、BP2007版以及ChP2005版附录中有关药物残留溶剂测定项目进行比较，其中前三类溶剂种类与限度均与ICHQ3C一致，对于第四类溶剂Chp2005和BP2007与ICHQ3C一致，USP30-NF25中用乙烷代替了ICHQ3C中的石油醚.一类溶剂种类及限度见附表一。1.2药典规定检测方法USP30-NF5对残留溶剂检测采用气相色谱法，其规定较为详细系统。被测定样品被分为水溶性样品和非水溶性样品，对于非水溶性样品常用N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二77甲基乙酰胺、1，3-二甲基-2-咪唑啉酮溶解。残留溶剂一般采用表二中方法A进行检测，当残留量等于或超过限量时，则要用表二中方法B进行验证和鉴定，当验证结果仍旧超过限量时则按照方法A测定结果进行定量。对于一些药物则按照各论中要求进行检测，大概可分为四种方法（见附表三），其中前三种方法较为普遍，第四种仅为个别药物各论中采用的条件，此处不再详细引述。当残留溶剂仅为三类溶剂时，则可采用干燥失重法测定，当失重超过0.5%时要对水分测定，以进行验证，或根据情况采用表二中两种气相色谱法直接进行检测和验证，必要时定量测定。在BP2007和ChP2005中均没有对仅存三类溶剂时可用燥失重法测定的描述；此外ChP2005中对于超过限量残留溶剂的验证和鉴定也未明确具体方法。BP采用A和B双系统气相色谱法测定药物中残留溶剂，①系统A的色谱条件：色谱柱：熔融毛细管柱30m×0.32mm(或0.53mm),以交联的6%氰丙基苯基一94%二甲基聚硅氧烷作为固定相(厚度:1.8µm或3µm)；载气：氮气或氦气，线速度35cm/s，分流比为1：5，检测器为氢火焰离子化检测器，也可采用质谱（MS）和电子捕获检测器（ECD），进样口温度为140℃，检测器温度为250℃，采用程序升温：初始温度40℃（20min），以10/min℃速度升温到240℃，维持20min。②系统B色谱条件：30m×0.32mm(或0.53mm)毛细管柱，采用聚乙二醇20000，厚度为0.25µm，程序升温：初始温度50℃（20min），以6/min℃速度升温到165℃，维持20min。进样口与检测器温度同系统A。有关药物残留溶剂检测项BP2007与BP2004变化不大。78ChP2005版药物残留溶剂测定项与ChP2000版则变动较大。昀大的改进是将非极性到极性的各种固定相的毛细管色谱柱用于残留溶剂测定中，并采用程序升温方法，提高了分离效率以及检测灵敏度，并建议对含卤素残留溶剂可采用ECD。具体有三种方法,均采用气相色谱法，第三法为直接进样法，未对色谱条件作出规定。第一法与第二法见附表四。通过简要介绍USP30-NF5、BP2007、ChP2005中有关药物残留溶剂检测项，根据所用方法、检测条件以及计算方法，比较归纳。见附表五2检测方法2.1气相色谱法气相色谱法是测定药物中残留有机溶剂昀适用的方法[6]，根据进样方式主要分为直接进样和顶空进样。直接进样适用于受热不易分解的物质，使样品溶解在适当溶剂后，抽取一定量样品溶液直接进样；色谱柱多采用填充柱或大口径毛细管柱[7]。这种进样方式简洁方便，但易污染进样口和色谱柱。当进样量小时，则检测灵敏度低；增大进样量则对色谱系统污染更加严重，当污染到检测系统，则使基底升高，噪音增大，影响检测灵敏度。当水为溶剂时，还易使色谱柱固定相流失，缩短使用寿命[8]。当以其他有机溶剂溶解样品时，则产生较大溶剂峰，使分析时间延长，而且往往分解产物和溶剂峰干扰测定，一般利用程序升温方法，使溶剂尽快除去。药物残留溶剂检测更为理想的方法为顶空毛细管气相色谱法[9]，目前顶空毛细管气相色谱法在国内已广泛应用于药品残留溶剂测定[10~14]。与直接进样相比，待测组分汽化后79在顶部富集，浓度比溶液中要增大很多，提高了检测灵敏度，也大大减少了样品溶剂以及样品本身对色谱系统的污染和对待测组分的干扰；同时样品溶剂不被注入色谱系统，缩短了分析时间，增加柱子寿命，提高了样品测定的重现性；并且毛细管色谱柱具有高效分离能力，能实现多组分分离检测。顶空进样只适用于有较高蒸汽压，低沸点溶剂的测定（沸点在100℃以下）[6]，并且顶空溶剂的纯度有较高要求，不能含低沸点易挥发杂质，否则会干扰待测组分检测。上述顶空进样是将样品溶解在适当溶剂后，顶空保温平衡后，抽取顶层气体进样。这也是昀普遍的顶空方式。但有些药物易水解或溶解性差，找不到合适顶空溶剂，则有研究者将药物粉碎后密封，直接顶空加热平衡，即固体顶空法测定药物残留溶剂[15~18]，吕志华、王远红[19]等采用水溶液顶空和固体顶空两种方法测定几丁糖酯中残留溶剂，水溶液顶空平衡温度为80℃，固体顶空平衡温度为150℃，两种方法测定结果一致，经显著性检验无显著性差异。王世亮[20]等测定植入用缓释氟尿嘧啶中环己烷残留量，植入用缓释氟尿嘧啶辅料几乎不溶于除环己烷外的其他常用溶剂，药典中方法并不适用，作者用气固顶空气相色谱法使药物在60℃顶空平衡后进样，实现了该制剂中残留溶剂的测定，并采用空白样品中加标准储备气的方法消除基质影响，但所用仪器设备要求较高，在加入标准气体时准确性易受多种因素影响。固体顶空气相色谱法一般需要较高的温度，否则残留溶剂难以从固体原料药中脱附，灵敏度低，针对这种情况，有研究者采用液固顶空法测定阿拉普利中有机溶剂残留[21]，并与液体顶空气相色谱法进行了比较，测定结果基本一致，作者用该方法80检测部分原料药中有机溶剂残留量，并获得了美国FDA和WHO认证。与固体顶空法相比，液固顶空则是加入内标溶液时量稍多，使固体药物湿润，以加大有机溶剂分子的流动性，加速固体药物中有机溶剂分子脱吸附，实现气、液、固快速平衡。由此也可看出,液固顶空是介于固体顶空与液体顶空之间的一种方法。收集近几年有关药物残留溶剂测定文献发现，主要都以溶剂溶解样品后顶空，即液体顶空应用广泛，固体顶空方法仅为唐庆华[15]等少数研究者采用。因此其适用性以及检测准确度有待研究者进一步验证。2.2其他方法药物中残留溶剂检测除气相色谱法外，还可采用其他方法，ICHQ3C中就指出，仅存在第三类溶剂时，可采用非专属性的方法如干燥失重来检查[5]。其次研究者也尝试用其他方法测定药物中残留溶剂量，如利用残留溶剂中的特殊元素,或者残留溶剂特殊的显色反应,用比色法测定其含量。文献[22]报道，可将药物进行氧瓶燃烧破坏后,用苯素氟蓝比色法测定氟,来换算药物中三氟乙酸的残留量,结果证明方法简便,灵敏,可靠。对于有紫外吸收的溶剂,可选用HPLC法[23.24]。郑丽芬用HPLC法[24]，以0.3%稀硝酸-乙腈（60：40）为流动相，用SpherisorbSCX色谱柱，柱温45℃，用waters430电导检测器测定盐酸头孢吡肟中有机溶剂N-甲基吡咯烷的残留量，结果准确可靠。Giron[25]综述了关于热重分析法（TGA）对药物中残留溶剂检测技术。昀近，近红外技术也被用于药物残留溶剂的在线检测[26]，具有高灵敏性和准确性。同时某些“电子嗅觉”芯片传感器也用于药物残留溶剂分析[27~29]，其灵敏度比气相色谱法要低10~100倍，但作为大样本、快速分析是81一种可贵尝试。3检测灵敏度灵敏度提高目前顶空毛细管气相色谱法是药物中残留溶剂测定的理想方法，具有顶空的高富集效率以及毛细管柱的高分离能力，因此检测灵敏度提高是基于顶空毛细管技术上的提高。大概可从两个方面考虑，一、扩大分流比，增加进样量。二、尽量提高顶部空气中待测组分浓度。据文献报道[30]，顶空瓶内气、液体积比，顶空溶剂对药物溶解度均影响药物残留溶剂检测灵敏度；可通过适当调整顶空体积或增大药物溶解量来提高检测灵敏度。此外待测组分达到气液平衡时在气相与液相的分配比也影响检测灵敏度，并建议根据待测物极性和沸点来选择易使残留溶剂逸出的顶空溶剂。文献[31]也曾就顶空溶剂对检测灵敏度影响进行研究，采用DMSO、DMF、二甲基乙酰胺（DMA）、苄醇（BA）、1，3二甲基-2-咪唑啉酮（DMI）和水为顶空溶剂，在相同顶空条件下测定17种溶剂残留量，结果表明不同顶空溶剂对同一待测物峰强度有很大影响，灵敏度昀大可差5~6倍。文献[32]采用新型绿色溶剂室温离子液体为顶空溶剂，利用其无蒸汽压、热稳定性好的性质实现甲酰胺等高沸点物质气相色谱法检测，同时文献[33]也以离子液体[Bmim]BF4为顶空溶剂，采用静态顶空气相色谱法测定阿德福韦酯中残留有机溶剂，并与DMSO为顶空溶剂时的检测灵敏度进行了比较，得出具有良好溶解性与热稳定性，低蒸汽压，对待测组分具有较小活度系数的介质是成为良好顶空溶剂的潜在条件。除上述因素外，也采用盐析的方法提高残留溶剂检测灵敏度[34]，文献[35]采用顶空气相色谱法测定非那雄胺中二氯甲82烷和氯仿残留量，并对硫酸钠、氯化钠、硫代硫酸钠的盐效应进行考察，结果表明并不是所有盐溶液都具有正效应，该实验中硫代硫酸钠则会抑制被测组分挥发。同时还可以通过采用固相微萃取等前处理技术[36~38]、特殊检测器[38~41]（MS/ECD）来提高灵敏度，或者采用联用技术，如：文献[42]采用顶空固相微萃取与氮磷检测器联用检测药物中N-乙烯基-2-吡咯烷酮和N-甲基-2-吡咯烷酮残留量，使灵敏度提高。文献[43]则采用吹扫捕集与质谱检测器联用测定阿莫西林胶囊中残留溶剂，并使检测限从µg级提高到ng级。4小结4.1各国药典中对药物残留溶剂检测从方法到限度规定越来越详细，严格。但ChP2005版在检测方法上与USP30-NF5、BP2007仍有一定差距，检测方法不够系统，对某些样品缺乏针对性。例如：对难溶于水的样品所用顶空溶剂或直接进样溶剂未做明确规定；对超过限量残留溶剂验证与鉴定所用方法未做详细规定等。但ChP2005版与ChP2000版比较仍有了很大改进，如：ChP2005中增用了毛细管柱测定法，极大提高了分离效率；而且采用了从非极性到极性各种固定相，便于根据实际情况具体操作，具有灵活性。4.2药物中残留溶剂的检测以顶空毛细管气相色谱法昀为普遍，但HPLC法、TGA和比色法等传统方法也是某些特殊残留组分检测的有效手段，并且昀近开展的近红外检测技术，以及“电子嗅觉”芯片技术，不仅是对气相色谱法的有益补充，而且对在线检测和大样本的快速分析检测具有重要意义。4.3药物中残留溶剂多为痕量，一般为10-6,因此需要检测方83法具有高灵敏度。目前顶空固相微萃取等技术已经广泛应用于样品前处理。此外各种高灵敏检测器的应用也可极大提高检测灵敏度，如质谱检测器，专门针对含卤素残留溶剂的电子捕获检测器，以及用于含氮物质的氮－磷检测器等专属性检测器。4.5特殊难溶性样品，多采用“万能溶剂”DMSO溶解，但是该溶剂纯度低，含有杂质，易干扰组分测定。而且除了在溶解性样影响检测灵敏度外，很多顶空溶剂自身对待测残留溶剂顶空富集效率也有很大区别。目前顶空溶剂对检测灵敏度的影响已开始受到关注，而且针对待测样品和待测残留溶剂，有针对性的选择顶空溶剂，也是提高检测灵敏度的关键。84附表Table1Class1solventsandtheirlimitinpharmacopeia溶剂USP30-NF25BP2007ChP2005苯2同USP同USP四