基于靶蛋白结构的CDK2小分子抑制剂研究进展.

ChineseJournalofNewDrugs2011,20(17期[基金项目]国家自然科学基金(81072577;中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(IMBF201004[作者简介]白晓光,男,博士研究生,研究方向为药物设计与合成。联系电话:[phone],E-mail:[e-mail]。[通讯作者]王菊仙,女,助理研究员,从事新药设计及药物合成研究。联系电话:[phone],E-mail:[e-mail]。·综述·基于靶蛋白结构的CDK2小分子抑制剂研究进展白晓光1,许乐幸1,李祎亮2,王玉成1,王菊仙1(1中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所,北京100050;2天津药物研究院分子设计与药物发现天津市重点实验室,天津300193[摘要]细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs活性的精确调控对细胞的增殖和转录至关重要,对于一些增殖性疾病特别是恶性肿瘤,细胞的生长和增殖失控与CDKs活性异常密切相关。对CDK2蛋白结构的认识,特别是一些抑制剂与CDK2复合物的晶体学认识,极大的推动了小分子抑制剂的设计和开发。本文对一些骨架相异的有临床开发价值的小分子抑制剂与CDK2激酶的相互作用进行了解析,对激酶的各结合区特征做了归纳,进而分析了目前该领域的研究状况和趋势。[关键词]细胞周期蛋白激酶2;抑制剂;晶体结构;结合;细胞周期[中图分类号]R979．1[文献标志码]A[文章编号]1003－3734(201117－1667－06Advanceinresearchofcyclin-dependentkinase2inhibitorsbasedonthestructuresoftargetproteinsBAIXiao-guang1,XULe-xing1,LIYi-liang2,WANGYu-cheng1,WANGJu-xian1(1InstituteofMedicalBiotechnology,PekingUnionMedicalCollege,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100050,China;2TianjinKeyLaboratoryofMolecularDesignandDrugDiscovery,TianjinInstituteofPharmaceuticalResearch,Tianjin300193,China[Abstract]Thepreciseregulationofcyclin-dependentkinases(CDKsactivityisessentialforcellularac-tivitiesincludingproliferationandtranscription．AbnormalCDKshavebeenstronglylinkedtouncontrolledcellgrowthandproliferationinanumberofproliferativedisorders,particularlyincancer．Inthisarticle,diversemolec-ularframeworksofsomepotentialinhibitorsanditsinteractionwithCDK2wereanalyzedandreviewed．Atlast,wesummarizedthepresentresearchanddiscussedthetrendsinthisfield．[Keywords]CDK2;inhibitor;crystalstructure;binding;cellcycle细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependentki-nases,CDKs是一类关键的细胞周期调控蛋白酶,该酶的活化与钝化维持着细胞周期各时相有序进行。细胞周期蛋白(cyclins或细胞周期蛋白的亚基对CDKs有正调控作用,而细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin-dependent-kinaseinhibitor,CKI对CDKs有负调控作用。研究表明,多数肿瘤的发生和发展均与细胞周期调控功能紊乱有关,如一些内源性抑制剂(如p16INK4A的缺失、细胞周期蛋白Cy-clinD1和CDK4的过表达、CDK底物(pRb,Retino-blastomaprotein的改变等均可引起细胞周期调控异常[1－2]。CDK2是完成G1期和进入S期一个非常关键的细胞周期蛋白依赖性激酶,CDK2与cyclinE结合ChineseJournalofNewDrugs2011,20(17并活化,维持G1后期pRb的磷酸化,保证细胞顺利通过G1期并进入S期。在S期初期,CDK2与cy-clinA结合使E2F转录因子钝化,而E2F的钝化是S期完成的前提条件,E2F活性的持续将导致细胞凋亡。因此,选择性地抑制CDK2/cylinA可能导致E2F浓度的升高,进而导致细胞S期停滞或凋亡。随着对CDK2蛋白结构的不断认识,近10多年来研究人员报道了越来越多的ATP竞争性小分子CDK2抑制剂。由于激酶在活性催化部位有着高度的序列相似性,所以小分子抑制剂的开发并非易事[3]。令人欣慰的是,通过药物生化学家的不断努力,目前已有若干对CDK2具有选择性抑制的小分子抑制剂进入临床研究,如flavopiridol、7-羟基十字孢碱(UCN-01、roscovitine(CYC202以及氨基噻唑类化合物(BMS-387032等,有望于不久的将来为临床医师提供更多的选择。1CDK2的蛋白结构与大多数的蛋白激酶类似,CDK2蛋白折叠呈双叶状[4]。体积较小的N-末端区主要由β-折叠构成,包括5个反平行结构的β-长链和一个C-螺旋。体积较大的C-末端区则主要由α-螺旋构成,并通过柔性铰链与N-末端相连接。而ATP的结合区就位于这两个“叶状”之间的深裂,构成该深裂的螺旋环是CDK2结构的独特之处,它决定着ATP或者蛋白结合底物与CDK2的特异性结合,在细胞调控机制中扮演着关键角色。引自JMedChem,2008,51:4986－4999图1CDK2与三磷酸腺苷(ATP的相互作用CDK2与ATP的相互作用如图1所示。按照众多CDKs小分子抑制剂与其作用方式,可将CDK2结合口袋划分为4个结合区:铰链区、Phe80浅腔、核糖/磷酸结合区和特异性表面区,如图2所示。许多已报道的高效、高特异性的小分子抑制剂对这些区均存在不同程度的靶向作用[5]。下面将通过一些有临床价值的小分子抑制剂对各个结合区进行讨论和分析。图26-位氧取代的嘌呤类化合物与CDK2的相互作用区域2小分子抑制剂与CDK2的作用方式2．1铰链区CDK2的铰链区(残基81-84分别与N末端和C末端相连,作为ATP重要的结合位点,它含有一组氢键供体和受体,是目前CDK2抑制剂设计的首选靶点。ATP腺嘌呤环与CDK2在该区有两条氢键作用,一条形成于嘌呤环上N1接受了主干上Leu83的NH,另一条形成于嘌呤环上N6的氨基NH提供给主干上Glu81的羰基氧(见图3。同样,目前已开发的众多小分子CDK2抑制剂都能够形成这两个氢键作用。并且,主干上Leu83上N的氢键供体特征是目前所有CDK2/抑制剂复合结构的保守特征。此外,目前已开发有相当数量的抑制剂还与主干上Leu83的羰基氧形成有第3条氢键作用。图3ATP在CDK2铰链区的氢键作用Flavopiridol(1是一个黄酮类的小分子半合成化合物,已进入Ⅱ期临床研究[6]。与CDK2的晶体结构显示其5-羟基和4-酮能分别与CDK2主干上ChineseJournalofNewDrugs2011,20(17期Glu81的羰基氧和Leu83的氨基NH形成两条氢键作用。作为第一代非选择性抑制剂,它对大多数的CDKs都有优异的抑制作用(CDK2/cyclinA,IC50=0．1μmol·L－1;CDK1/cyclinB,IC50=0．4μmol·L－1;CDK4/cyclinD,IC50=0．4μmol·L－1,能够使许多细胞系细胞周期停滞。目前,虽然不同结构修饰的flavopiridol类似物也在不断开发中[7],但它们的抗增殖活性以及对CDK2/CyclinA抑制活性尚明显低于flavopiridol。化合物1结构式见图4。图4flavopiridol结构式R-roscovitine(2是第二代嘌呤类衍生物CDKs抑制剂,临床前研究已证实它能够作用于多个细胞周期时相,并能够引起细胞周期停滞和凋亡[8]。与flavopiridol类似,除了嘌呤咪唑环上8-位H和7-N分别与CDK2主干上Glu81的羰基氧和Leu83的NH形成两条氢键作用以外,嘧啶环上的6-NH与Leu83的羰基氧形成有第3条氢键作用。它对CDK2/cyclinE的抑制IC50达到了0．7μmol·L－1。目前(R-roscovitine已进入Ⅱ期临床研究,具有较好的口服生物利用度,并且roscovitine的类似衍生物仍在不断的开发中[9－10]。化合物2结构式见图5。图5R-roscovitine结构式除了以上2种有代表性骨架与CDK2铰链区的Glu81和Leu83形成氢键作用以外,还有很多类似氢键作用形式的小分子化合物,如已进入临床前或临床评价阶段的下列化合物均与CDK2该铰链区有23条的氢键作用:SNS-032(BMS-387032,R547(Ro-458820,AG-24322,AT7519,ZK-304709,E7070,AZD5438,PD-0332991等[11－12]。2．2Phe80浅腔Phe80浅腔是CDK2在ATP结合区侧后方一个由Ala31,Val64,Phe80和Ala144形成的隐埋浅疏水区。尽管ATP本身并未对其有占据,但已发现有很多抑制剂如十字孢碱(staurospo-rine、靛玉红以及hymenialdisine等均有疏水环占据该浅腔。近年来研究者对该浅腔也产生越来越浓厚的兴趣,发现该浅腔只能容纳体积较小的疏水性基团,对该浅腔不同程度占据将会引起小分子抑制剂活性和选择性的改变[13]。Brasca等[14]曾报道一类吡唑并喹唑啉CDK小分子抑制剂,其中化合物3(PHA-848125的临床前试验表明它对异种移植的人A2780卵巢癌模型具有良好的抑制活性和耐受度,对一些前列腺、胰腺、乳腺有关的实体瘤也有显著疗效,目前已进入Ⅰ期临床和Ⅱ期临床研究。PHA-848125与CDK2/cyclinA的晶体结构显示,除了吡唑并喹唑啉上7位N和邻近8位上NH与主干Leu83分别形成两条氢键作用以外,4位C上的取代基则指向Phe80浅疏水区。研究者发现在4位上引入一些小的疏水性残基如二甲基可增强其在该隐埋区的疏水性。与化合物4相比,引入二甲基后的PHA-848125对Aura-A的抑制活性明显降低,但仍能保留对CDK2/cyclinA的高抑制水平,进而提高了对CDK2/A的特异性[3(PHA-848125与4对CDK2/A的IC50值都为45nmol·L－1,但对Aura-A的IC50值分别为1051和175nmol·L－1]。这是因为疏水性基团二甲基与CDK2隐埋区(看门残基Phe80、侧链Val64和Aura-A的隐埋区(看门残基Leu210、侧链Leu194相互作用不同,3(PHA-848125具有更好的空间匹配。化合物34的结构式见图6。图6PHA-848125和化合物4的结构式ChineseJournalofNewDrugs2011,20(17此外,Williamson等[15]报道的磺酰基苯胺类似物5(CDK2的IC50=0．23μmol·L－1;GSK-3β的IC50为11μmol·L－1的吡唑并嘧啶环3-位上的异丙基取代基,Stevens等[16]报道的化合物6的吡唑并哒嗪环上2-位R取代基改变所引起的CDK2和CDK4活性的显著变化,都说明对Phe80浅腔选择性的占据将会引起小分子抑制剂对靶酶选择性的改变。因此,在设计C