药物制剂的微生物学检验

第八章药物制剂的微生物学检验第一节药物的抗菌试验第二节灭菌制剂的无菌检查法第三节非灭菌制剂的微生物限度检查第一节药物的抗菌试验药物的抗菌试验体内抗菌试验体外抗菌试验药物的体外抗菌试验包括用于区别药物是抑菌或杀菌药物的抑菌试验；测定药物杀菌活性的杀菌试验；以及检查两种药物联合作用的联合抗菌试验等。一般抑菌药物只能抑制微生物生长，不能杀死微生物，抑菌药物被除去，微生物又可以恢复继续生长。杀菌药物能杀死微生物，杀菌药物除去后，微生物仍然不能生长。药物的抑菌作用或杀菌作用是在一定条件下相对而言的。在我们检测时，药物的作用受到用药时培养基的组成、温度、PH值及所用的菌种、菌量等各个因素有关。虽然说体外抗菌试验有很多优点，但是由于体外抗菌试验没有复杂的体内因素影响，因此药物体外抗菌试验和体内抗菌试验可能会出现不一致的结果。所以，一般我们在体外对药物进行测试后，有效的药再要进行体内试验，如果体内试验再次证实此药有效的话，才能推荐应用到临床。一.药物的体外抑菌试验(一).药物的体外抑菌试验药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法，其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法。1.稀释法稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法两种。这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用μg∕ml或U/ml表示。具体的液体培养基连续稀释法见书P224，固体培养基连续稀释法，又可分为平板法和斜面法。2.琼脂扩散法利用药物在琼脂培养基中扩散，并在一定浓度范围内抑制细菌生长的原理进行的。一般用于细菌和酵母菌的药敏试验。（1）.滤纸片法（纸碟法）滤纸片法是最常用的方法，适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用）及临床的药敏试验（细菌药物第三性试验、以便选择用药）。滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片。一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些。至于干燥纸片的制备方法：选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆纸片，120℃干燥灭菌2小时。然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液，每100张纸片加入0.5ml药液，使它均匀浸润，放在无菌平皿中，37℃，使它干燥，分装小瓶中，封口，4℃保存。如果是β－内酰胺类抗生素还要放在-20℃保存。这就制成了干燥的含药液的纸片。一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈大小来判断，比如：抗生素或化疗药物抑菌圈直径（mm）耐药中敏敏感氯霉素≤1213-17≥18红霉素≤1314-17≥18四环素≤1415-18≥19卡那霉素≤1314-17≥18（2）.打洞法在含菌琼脂平板上打洞（一般打6个孔，4个小孔加不同浓度标准溶液，另外2个小孔加血清样品，放在37℃，12-18小时，测定其抑菌圈直径。所以说微量法适于药物血浓度的监测。优点是微量（血清用量少）敏感，操作简便。除此之外还有管碟法、直接滴加法和挖沟法：适用于测试一种药物对几种细菌的抗菌作用。方法是先制备普通琼脂平板，并在平板上挖直沟，在沟内滴加药液，在沟侧接种细菌。经过培养以后观察家细菌生长的情况。我们可以根据沟和细菌间的抑菌距离的长短，来判断该药物对这些细菌的抗菌能力。(二).药物的体外杀菌试验杀菌试验是用来评价药物对微生物的致死活性的。1.最低杀菌浓度（MBC）（最小致死浓度MLC）的测定按液体培养基稀释法的操作方法测了药物的MIC。然后把未长出菌的各个试管培养液分别移种到无菌平板上，培养后凡是平板上无菌生长的药物最低浓度就是最小致死浓度（MLC）。如果是细菌的话可以称为最小杀菌浓度（MBC）。2.活菌计数法将定量的试验菌加入到一定浓度的定量药物中，作用一定时间后，取样进行活菌数计数，从存活的微生物数量计算出药物对试验菌的致死率，从而判断药物的杀菌能力。活菌计数一般是将定量的药物与试验菌作用后混合液稀释后，混入琼脂培养基做成平板，培养后数平板上形成的菌落数，由于一个菌落是由一个细菌繁殖而来的，所以可以用菌数乘以稀释倍数，计算出混合液中存活的细菌数。或者也可以用微孔滤膜过滤药物与试验菌的混合液，洗净药液，将滤膜放在平板上培养后数菌落数。3.酚系数测定（石炭酸系数测定）酚系数是以酚为标准，将待测的化学消毒剂与杀菌效力相比较，所得的就是杀菌效力的比值。由于各种化学消毒剂杀菌原理各不相同，因而这种方法仅仅适用于酚类消毒剂杀菌效力的测定。苯酚系数＝消毒剂的杀菌稀释度/苯酚的杀菌稀释度苯酚系数≥2为合格(三).联合抗菌试验联合抗菌试验主要用于测定两种抗菌药物联合应用时的相互影响。联合抗菌试验可能出现4种结果：①无关作用，两种药物联合作用的活性等于其单独活性；②拮抗作用，两种药物联合作用显著低于单独抗菌活性；③累加作用，两种药物联合作用时的活性等于两种单独抗菌活性之和；④协同作用，两种药物联合作用显著大于其单独作用的总和。联合药物敏感试验和杀菌试验意义目的在于：①治疗混合性感染；②预防或推迟细菌抗生素耐药性的发生；③联合用药可以减少剂量以避免达到毒性剂量；④联合用药比单一用药时效果更好。1.棋盘格法•FIC指数•0.75为协同作用•0.75～1为相加作用•1～2为无关作用•＞2为拮抗作用2.纸条试验在含菌平板上垂直放两条浸有不同药液的滤纸条，培养后观察两药形成的抑菌区的图形来判断两药联合应用时，是无关、协同还是拮抗作用。3.纸条梯度平板试验将琼脂培养基倒入平皿，平皿斜放凝固后制成斜面培养基。将平皿放平加入含抗菌药物的琼脂培养基，这样在制成的双层琼脂平板中含有梯度浓度的抗菌药物。要求其最小抑菌浓度的位置约处于平板的一半。然后将试验菌液均匀涂布在平板表面。取纸条浸透另一待检药液，按梯度中药物浓度递减的方向置于平板表面，培养后观察形成的抑菌区的图形以判断两种药物之间的相互作用。二.药物的体内抑菌试验药物的体内抗菌试验又称为动物实验治疗试验或保护力试验。当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内各种因素的影响。如血液及组织内的蛋白质或磷脂、脓汁内的核酸均与药物结合，降低药物的活性；坏死组织内的酸性环境也能影响药物的活性。机体内的微生物，代谢活动较低，对药物的敏感性降低，有时还可形成细胞壁缺陷型细菌，对某些药物不敏感。机体内各组织中药物的吸收，分布不同，使药物的浓度难以恒定。因此在评定新药的药效时除做体外抗菌试验外还需要做体内的抗菌试验。三.影响抗菌试验的因素1.菌种在抗菌试验中所用到的菌种，必需是国家卫生部生物制品检定所菌各保藏中心专门提供的标准菌株。在特殊情况下，也可以采用临床新分离的并经过鉴定、纯化及合理保藏的菌株。而且我们要用到的试验菌种应该选择是对数期生长的菌。因为那时菌种生命力最旺盛，这对于试验测定的结果也会准确些。2.培养基试验所有到的培养基应按各试验菌的营养要求进行配制，严格控制各种原料、成分的质量及培养基的配制过程。要注意当有些药物具有抗代谢作用时，培养基应不能存在代谢物，否则抑菌作用将会被消除。培养基内如果含有血清等蛋白质时，有可能与某些抗菌药物结合，使抗菌药物失去，所以就要避免培养基混进这类营养物。3.抗菌药物药物的物理状态、浓度、稀释方法等都会直接影响抗菌试验的结果，必需精确配制。如果是固体药物，必需使药物溶解或使药物呈均匀悬液，PH值应调至中性，以确保药物的稳定性和不影响细菌的生长。中草药因为有颜色和含有鞣质，结果的判断，应特别注意。•2.对照试验为确保试验结果的科学性和准确性，试验时应同时进行各种对照试验。试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长。溶剂及稀释液对照：配制抗菌药物时所用的溶剂及稀释液均应无抗菌作用。已知药物对照：应使已知抗菌药物对标准菌株出现抗菌效应。实验细菌对药物敏感性的实验（药敏片扩散法）目的意义：掌握药敏片扩散法进行药敏实验的一般方法体会药敏实验在临床用药上的指导意义。基本原理：药敏片是含有抗生素的滤纸片，将其置于涂满待测菌的固体培养基上，抗菌药物通过向培养基内扩散，抑制细菌生长，从而出现抑菌环。根据抑菌环的大小可以判定细胞对此药物的敏感度。器材及试剂:药敏片：含各种抗生素的市售产品培养基平板：普通牛肉膏蛋白胨固体培养基，待检细菌的培养物。眼科镊、无菌棉拭子、酒精灯等。实验步骤:1.用无菌棉拭子沾取小量待测菌液，均匀涂布平板，待稍干后，用无菌眼科镊将各种药敏片分别平贴在平板培养基表面，每板4-6个，相互间应有一定距离（15mm）。2.置37℃，培养16-18h，观察结果。3.结果判定：观察有无抑菌圈及测量其直径，按下表判定对药物的敏感性。抗菌药物纸片含药量（ug）抑菌环直径（mm）耐药中度敏感敏感丁胺卡那霉素30≤415-16≥7头孢唑啉30≤1415-17≥18先锋霉素I75≤1516-20≥21头孢噻吩30≤1415-17≥18头孢噻甲羧肟30≤1415-17≥18氯霉素30≤1213-17≥18红霉素15≤1313-15≥18庆大霉素10≤1213-14≥15微生物污染药物——药源性疾病药物制剂的微生物学检查规定灭菌制剂非规定灭菌制剂（口服及外用药）无菌检查染菌数量和种类的限度检查无菌制剂注射用制剂眼用制剂植入型制剂创伤用制剂手术用制剂注射剂、输液、注射粉针滴眼剂、眼用膜剂、软膏剂、凝胶剂植入片溃疡、烧伤及外伤用溶剂止血海棉、骨蜡第二节灭菌制剂的无菌检查法•中国药典2005年版共包含10种剂型：•1.注射剂•2.眼内注射溶液、眼内插入剂及供手术、伤口、•角膜穿通用的眼用制剂•3.用于烧伤、创伤或溃疡的气雾剂、喷雾剂•4.用于烧伤或创伤的局部用散剂•5.用于手术、耳部伤口或耳膜穿孔的滴耳剂与洗耳剂•6.用于烧伤或创伤的鼻用制剂•7.用于冲洗开放性伤口或腔体的无菌溶剂•8.用于烧伤或严重创伤的软膏剂及乳膏剂•9.用于严重创伤的凝胶剂10.植入剂。一.无菌检查的范围严格进行无菌操作试验设备、试验环境、试验器具、试验材料等应符合无菌要求。试验的全过程必须严格遵守无菌操作，以防止微生物污染。正确进行样品采集抽样方法抽样量与合格率二.无菌检查的基本原则三.常用的无菌检查法薄膜过滤法适用于有抗菌作用或大容量的供试品直接接种法适用于非抗菌作用的供试品一般药品的无菌检查—直接接种法配制培养基——无菌检查用培养基1.需氧菌培养基2.厌氧菌培养基3.真菌培养基接种培养阴性对照及阳性对照1.阴性对照2.阳性对照结果判断无菌检查用的培养基需氧菌、厌氧菌培养基(硫乙醇酸盐液体培养基)酪胨(胰酶水解)15g葡萄糖5gL－胱氨酸0.5g硫乙醇酸钠0.5g(或硫乙醇酸)0.3ml酵母浸出粉5g氯化钠2.5g新鲜配制的0.1%刃天青溶液1.0ml（或新鲜配制的0.2%亚甲蓝溶液)0.5ml水1000ml真菌培养基（改良马丁培养基）胨5g酵母浸出粉2g葡萄糖20g磷酸氢二钾(K2HPO4)1g硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g蒸馏水1000ml选择性培养基对氨基苯甲酸(PABA)培养基：用于磺胺类药物的无菌检查照需氧菌、厌氧菌培养基及真菌培养基处方及制法，各加对氨基苯甲酸0.125g，溶解后，摇匀，分装，灭菌。聚山梨酸培养基：用于油剂药品的无菌检查照需氧菌、厌氧菌培养基及真菌培养基处方及制法，每1000ml培养基中各加10ml聚山梨酸-80，摇匀后，分装，灭菌。接种与培养需氧菌培养基厌氧菌培养基真菌培养基供试品30~36℃，5天。20~25℃，7天接种培养供试品检查的接种量、培养基装量和取供试品中国药典2005版单位：ml供试品装量每管接种量直接接种法培养基量薄膜过滤法接种培养基量取供试品数(瓶、支)1或1以下全量15112-5以下半量15115-20以下2151120-50以下5401150-100以下(静脉)全量-1005100-500全量-1005500以上500-1005无菌粉针剂11无菌粉末原料6份各0.5g各种培养基种类、数量及培养温