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RNA提取方法及原理John1、研究背景1.1RNA研究的重要性DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。1.2RNA分布不同丰度组织名称样品量总RNA含量高丰度肝脏1mg2-4μg脾脏1mg心脏1mg中丰度大脑1mg0.05-2μg胚胎1mg肾脏1mg肺1mg低丰度膀胱1mg0-0.05μg骨1mg脂肪1mg高丰度成纤细胞1050.5-1μg人白细胞105中丰度酵母1050.5-1.5μg拟南芥叶片1mg0.2-0.5μg低丰度烟草叶片1mg0.05-0.1μg玉米叶片1mg2、方法及原理2.1RNA的提取流程1、样本前处理2、细胞裂解3、RNA的纯化及获得RNA提取流程－－样品前处理注意点选择新鲜血液，不得超过4小时选择新鲜的幼嫩组织选择处于生长旺盛的时期收集细胞选择新鲜组织，生长旺盛的组织可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存较长时间去掉培养基，加入一定量TRNzol-70℃保存较长时间推荐使用专门的RNA样品储存液进行储存液氮或加入RNase抑制剂中保存，避免反复冻融RNA提取流程－－样品前处理中如何保存样本RNA提取流程－－细胞裂解，以释放RNA异硫氰酸胍/酚－TRNzol总RNA提取试剂独特配方--RNAplant植物RNA提取试剂胍盐/β-巯基乙醇—RNAprep系列RNA提取试剂盒RNA提取流程－－RNA的纯化及获得RNA纯化要求1纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质2排除有机溶剂和金属离子的污染3蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度4排除DNA分子的污染2.2RNA提取的注意事项2.2.1杜绝外源酶的污染一：严格戴好口罩，手套。二：实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。2.2.2阻止内源酶的活性一：选择合适的匀浆方法。二：选择合适的裂解液。三：控制好样品的起始量。2.3Rnase污染的10大来源1：手指头2：枪头3：水/缓冲液4：实验台面5：内源Rnase6：RNA样品7：质粒抽提8：RNA保存9：阳离子(Ca,Mg)10：后续实验所用的酶2.4几种RNA提取方法2.4.1TRIzol法TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。TRIzol法提取流程1．样品处理：（１）培养细胞：收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1mlTrizol，混匀，室温静置5min。（２）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1mlTrizol充分匀浆，室温静置５min。2．加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。3．4℃离心，12000g×15min，取上清。4．加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。5．4℃离心，12000g×10min，弃上清。6．加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。7.晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。细胞基因组DNA水相有机相RNA氯仿纯化pH5.7离心加入裂解液(TRNzol-A+)实验流程图细胞选择贴壁细胞悬浮细胞2.4.2苯酚法细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodiumdodecylsulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。苯酚法提取酵母RNA取1g活性干酵母在研钵中研碎，加10mLSDS-缓冲液使成匀浆，洗入各Eppendorf管（略少于管容积的一半），加溶菌酶0.1mL，混匀，室温静置10min，再加等体积饱和酚液，室温下剧烈振荡5min。置冰浴中分层，在0-4℃低温环境下，10000r/min离心10min。吸出上层清液，转入新的Eppendorf管，加等体积氯仿-异戊醇，室温下剧烈振荡2.5min，然后10000r/min离心5min。吸出上层清液，转入另一新Eppendorf管，加2倍体积95％乙醇（含2％乙酸钾），在冰浴中放置30min，使RNA沉淀。再以10000r/min离心5min，弃上清液，沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次，即加乙醇或乙醚，迅速离心各1min，保留沉淀。倾去乙醚后，减压真空干燥，准确称重，记录。2.4.3异硫氰酸胍—酚法异硫氰酸胍—酚法提取RNA的原理如下：GIT与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT与十二烷基肌氨酸钠（Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。该法所提RNA纯度高完整性好较适合纯化mRNA，逆转录及构建cDNA文库。异硫氰酸胍—酚法提取植物组织总RNA1）取2g左右植物组织放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至粉末状。加4－5mL异硫氰酸胍溶液。转移到小离心管中，每管0.5mL。2）置于冰上，顺序加入：50μl2mol/LNaAc,混匀，0.5mL水饱和酚，170μlCI，混匀。置冰上15min。3）各管平衡后，4℃,12000g离心20-30min。转移上清到另一管中，加入等体积的异丙醇，混匀，－20℃沉淀30min-1hr或－80℃沉淀10min。4℃,12000g离心20min回收RNA。4）用70％乙醇洗一次，4℃，12000g离心5min。吸去乙醇，空气中吹干RNA沉淀。用150μl异硫氰酸胍溶液，65℃吹打RNA沉淀溶解。5）加等体积异丙醇－20℃沉淀30min-1hr或－80℃沉淀10min。4℃,12000g离心20min回收RNA。6）用70％乙醇洗两次后，吹干溶于适量的DEPC－H2O中。部分分装后进行纯度及完整性的检测。其余加2.5倍体积乙醇沉淀于－80℃冰箱中存放。7）紫外分光光度分析纯度和含量，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析完整性。植物病毒的RNA提取大多植物病毒RNA为单链RNA，并且其极性与mRNA极性相同，植物病毒RNA提取较为简单，一般使用酚氯仿即可获得满意结果。一、材料提纯TMV病毒液（10mg/ml）。二、设备冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳仪，电泳槽。三、试剂TE-饱和酚:氯仿（1:1），氯仿，3MNaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE缓冲液，无RNA酶的双菌水。操作步骤1、取一eppendorf管加入提纯TMV（10mg/ml)400ml，再加入等体积酚/氯仿，盖紧管盖后用手充分振荡1分钟，4℃下12000g离心10分钟。2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有机相交界面无蛋白为止。3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等体积氯仿，用手倒置离心管数十秒，4℃下12000g离心10分钟。4、取水相，加入1/10倍体积的3mol/LNaAc(pH5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。5、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。6、小心弃去上清液，沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟，并溶于无RNA酶的双菌水或TE缓冲液中。7、取10ml进行电泳分析，另10ml用于cDNA合成。动植物组织mRNA提取一、材料水稻叶片或小鼠肝组织。二、设备研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。三、试剂1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/LTris·Cl(pH7.6)，0.5mol/LNaCl，1mmol/LEDTA(pH8.0)，0.1%SDS。4、洗脱缓冲液：10mmol/LTris·Cl(pH7.6)，1mmol/LEDTA(pH8.0)，0.05%SDS。操作步骤（一）动植物总RNA提取-Trizol法Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。4、弃去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。[注意]1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年谢谢