药理学试验五-PowerPointPresentati

北京协和医学院八年制临床医学生药理学实验药理学系郭磊腺苷酸环化酶活性测定相关背景实验原理实验步骤问题讨论BackgroundReviewcAMP是多种激素、神经递质等作用于细胞时的第二信使物质。由腺苷酸环化酶AC催化ATP分解而成。ATPcAMP＋ppiACBackgroundReviewcAMP生成以后又在环磷酸腺苷酸二酯酶（PDE）的作用下分解失活。这样AC和PDE共同维持体内的cAMP的动态平衡。cAMP的浓度与细胞效应密切相关，因而调节AC以及PDE的活性即可以影响细胞的功能，其中AC活性的调节乃多种受体激活产生细胞效应的中心环节之一。BackgroundReview中枢神经系统中存在多个多巴胺效应系统，其中尾状核是多巴胺受体分布较为丰富的区域，其作用与调节锥体外系的功能有关。多巴胺与细胞表面的受体结合，通过影响AC活性而发挥作用，很多抗精神病的药物是多巴胺受点的拮抗剂，这些药物不仅能抑制多巴胺与受体的结合，而且也抑制AC的活性。腺苷酸环化酶活性测定相关背景实验原理实验步骤问题讨论Principle本实验采用非标记底物法测定AC活性。即用非标记的ATP作底物，其被AC催化所形成的cAMP可以不经过分离通过蛋白竞争结合法直接进行含量测定，方法简便灵敏度高。非标记底物测定cAMP浓度，间接推测AC活性的大小，同时观察多巴胺和氟哌啶酶对AC活性的影响。AlfredG.Gilman腺苷酸环化酶活性测定相关背景实验原理实验步骤问题讨论Procedure配制标准cAMP浓度梯度：母液100ulT.E32pmol/100ul16pmol/100ul8pmol/100ul4pmol/100ul100ulT.E100ulT.E100ul100ul100ul100ul母液100ulT.EProcedure取小试管10支，依次编号，置试管架中。按下表加入各种试剂123456分组编号Tris苹果酸缓冲液200μM多巴胺μl250μM氟哌啶醇μl10mMATPμlA1－2350————50B3－4350————50C5－630050——50D7－8300——5050E9－10250505050Procedure开动计时器，同时向第一管中加入大鼠尾状核匀浆液，100μl，摇匀。每间隔10s，向下一管中加入大鼠尾状核匀浆液，100μl，摇匀。1－2管：立即置沸水浴中，煮沸5min。取出，置冰浴中，10min。Procedure分类分组编号TEμl标准品cAMPμl待测样品μl3H－cAMPμl结合蛋白μl摇匀，4摄氏度放置2小时活性炭μl10000rpm离心5min，取上清200μl，测定放射性。比较管CT1－2250——50——B3－4150——50—100C05－6100——5050100标准管S17－8—100—5050100……………………S719－20—100—5050100样品管A23－24——1005050100B25－26——1005050100C27－28——1005050100D29－30——1005050100E31－32——10050501004000rpm离心5min，各管取上清100μl按下表加样Procedure然后加活性炭混悬液，立即12000rpm离心5min。小心吸取上清200μl，转入液闪瓶中，加5ml闪烁液，加3ml无水乙醇。（本实验中为已经配好的混合液，吸取两次，每次4ml即可）加盖摇匀，过夜。测闪烁计数现在我们应用更先进的液体闪烁计数仪，由计算机控制，更灵敏、更准确。腺苷酸环化酶活性测定相关背景实验原理实验步骤问题讨论Discussion本实验为微量实验，所以加样等操作精确度对结果影响很大–各管加样准确–各组时间平行Discussion加入活性碳后应立即离心因活性炭对游离3H-CAMP的吸附存在动态平衡，吸附时间过长可能造成反应产物的解离，影响试验结果。DiscussionBSA的作用？加入ATP的作用？加入无水乙醇的作用？加入沸水浴的作用？倍比稀释的优点与缺点？分析可能影响试验结果的因素，并讨论如何控制这些因素优化试验Discussion根据药理学的理论知识预测试验的结果；用合适的方法分析并解释你自己得到的数据和结论。谢谢大家就讲这么多