细菌鉴定中常用的生理生化反应

实验八细菌鉴定中常用的生理生化反应实验目的和内容了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应的测定方法；通过不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况，了解细菌碳、氮代谢类型的多样性；了解细菌在不同培养基中的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义；实验仪器、材料和用具实验仪器37℃恒温培养箱、20℃恒温培养箱（室温代替）。微生物材料大肠杆菌、枯草杆菌这二种菌种的斜面各1支。试剂甲基红试剂、V．P试剂、吲哚试剂、格里斯试剂(硝酸盐利用试验)、卢戈氏碘液(淀粉水解试验)实验仪器、材料和用具实验用具试管：每份每个试验2支试验，8个试验共16支。无菌平皿：每份2个杜氏小管：每份4个。接种环、酒精灯、试管架、记号笔。实验仪器、材料和用具培养基1葡萄糖发酵培养基2乳糖发酵培养基3甲基红(葡萄糖蛋白胨水培养基)4V.P试验(葡萄糖蛋白胨水培养基)5柠檬酸盐利用试验（柠檬酸盐利用试验）6吲哚试验(蛋白水培养基)7硫化氢试验(硫化氢培养基)8淀粉培养基实验原理细菌生化试验各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。实验原理－－细菌生化试验糖(醇)类发酵试验不同的细菌含有发酵不同糖(醇)的酶，因而发酵糖(醇)的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5.2(黄色)一6.8(紫色)]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。实验步骤糖(醇)类发酵试验编号在各试管上分别标明发酵培养基名称，所接种的菌名和组号，下同。接种取葡萄糖发酵培养基2支，按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种枯草杆菌。同样取2支乳糖发酵培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种枯草杆菌。将已接种好的培养基置37℃温箱中培养24h。观察结果：被检细菌若能发酵培养基中的糖时，则使培养基的pH降低，这时培养基中的指示剂呈酸性反应(为黄色)，若发酵培养基中的糖产酸产气，则培养基不仅显酸色反应，并且在培养基中倒置的小玻璃管(杜氏小管)中有气体。气体占整个倒置小玻管的10％以上。若被检细菌不分解培养基中的糖，则培养基不发生变化。实验结果糖发酵实验CarbohydratefermentationIMViC试验甲基红(Methylred)试验V.P试验吲哚试验柠檬酸盐利用试验甲基红(Methylred)试验(简称MR试验)很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降低到4.2以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是pH4.4(红色)～pH6.2(黄色)。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱羧，转化成醇等物，则培养基的pH仍在6.2以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。实验步骤甲基红试验(MR试验)将大肠杆菌和枯草杆菌分别接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养48h，加甲基红指示剂数滴，观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。MethylRedTestV.P试验测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，该物质在碱性条件下被空气中的氧气氧化成二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸中的胍基作用生成红色化合物。实验步骤伏-普二氏试验(V.P试验)将被检菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养48h，取出，倒掉一半培养液，加入40％KOH5～10滴，然后再加入等量的5％－萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃温箱中保温15～30min，以加快反应速度。若培养物呈现红色，为伏－普反应阳性。Voges-ProskauerTest实验原理－－有机酸盐及氨盐利用试验柠檬酸盐利用试验柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢铵是氮的唯一来源。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂（PH＜6.0时呈黄色，PH在6.0~7.0时为绿色，PH＞7.6时呈蓝色）由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。实验步骤柠檬酸盐利用试验取少量被检菌接种到柠檬酸盐培养基上，37℃培养24h后，观察结果。培养基变深蓝色者为阳性。培养基不变色，则继续培养7天，培养基仍不变色者为阴性。CitrateTest实验原理靛基质(吲哚)试验某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质(吲哚)，靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质(红色化合物)。实验步骤靛基质(吲哚)试验将被检菌接种到胰蛋白胨水培养基中，37℃培养24h～48h后，加入10-20滴乙醚，振荡数次，静置1－3分钟，沿试管壁滴加2滴吲哚试剂于培养物液面，观察结果。出现红色者为阳性，出现黄色者为阴性。IndoleTest硫化氢试验某些细菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等)，产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。实验步骤硫化氢试验：将大肠杆菌和枯草杆菌以接种硫化氢培养基中，37℃培养24h，观察结果，若有黑色出现者为阳性。将滤纸条插入试管，滤纸条的最下端离液面上方1cm。最上端露在试管口外。实验原理－－大分子物质代谢实验淀粉水解试验细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶(淀粉酶)将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖)，再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。实验步骤淀粉水解试验将配制好的淀粉培养基冷却到50℃左右，以无菌操作制成平板。用接种环取少许枯草杆菌划线接种在平板的一边，再取少许大肠杆菌划线接种在平板的另一边。置37℃温箱培养24h。将平皿取出，打开皿盖，滴加少量卢戈氏碘液于平板上，轻轻摇动平皿，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的大小。记录12345678Escherichiacoli+++--+--Bacillussubtilis---++-++结果与讨论记录上述各试验结果在吲哚试验和硫化氢试验中细菌各分解何种氨基酸?结合大肠杆菌与枯草杆菌的糖代谢途径分析试验结果实验七结果观察