药用芦荟中芦荟苷的提取分离及含量测定

药用芦荟中芦荟苷的提取分离及含量测定刘玉魁１，郭迎霞２，赵作连２，杨世强１（１．河北省峰峰集团邯郸医院药剂科，０５６００２；２．河北省邯郸市药品检验所，０５６００１）［摘　要］　目的　从百合科植物芦荟中提取芦荟苷并进行分离、鉴定及含量测定。方法　采用葡聚糖凝胶分子筛结合层析法提取芦荟中芦荟苷；采用理化和薄层色谱法进行定性鉴别；采用高效液相色谱法进行定量分析。结果　库拉索芦荟中芦荟苷的含量为２５．５％；好望角芦荟中芦荟苷的含量为２０．１％。结论　应用现代科学对芦荟中主要有效成分进行提取分离，为开发我国芦荟资源提供了可行性，并为研制芦荟系列保健品与药品提供科学依据。［关键词］　芦荟；芦荟苷；提取；鉴定；含量测定［中图分类号］　Ｒ２８４．２；Ｒ９２７．２　　　［文献标识码］　Ａ　　　［文章编号］　１００４０７８１（２００７）０４０４１３０２　　中药材芦荟为百合科植物库拉索芦荟（ＡｌｏｅｂａｒｂａｄｅｎｓｉｓＭｉｌｌｅｒ）、好望角芦荟（ＡｌｏｅｆｅｒｏｘＭｉｌｌｅｒ）或其他同属近缘植物叶的液汁浓缩干燥物。库拉索芦荟习称“老芦荟”，好望角芦荟习称“新芦荟”，我国南部有栽培。祖国医学认为“芦荟”性寒、味苦，清肝热、通便，用于便秘、小儿疳积惊风，外治湿癣。近年来随着对芦荟植物研究的深入，芦荟的应用价值逐渐被人们认识。应用现代科学的手段对芦荟中主要有效成分进行提取分离，已逐步发现芦荟植物中含有蒽醌类、酮类等十几类化合物。药理实验证明芦荟在人、大鼠中较易出现泻下作用。芦荟苷具有增加大肠液分泌、增加脂肪酶活性刺激失调的大肠自主神经，有增进食欲和大肠缓泻作用。目前国内已有芦荟系列产品上市，但芦荟苷的提取工艺及质量控制不详。为此，笔者以中药材库拉索芦荟和好望角芦荟为提取检测对象，采用三氯甲烷提取，以葡聚糖凝胶分子筛结合层析法精制，选用Ｆｅｉｇｌ和Ｂｏｒｎｔｒａｇｅｒｓ等反应及薄层色谱法进行鉴定，并建立了高效液相色谱法的含量测定方法。１　仪器与材料　１．１　仪器　ＦＡ１００４型上皿电子天平（上海），ＵＶ２２０１型紫外分光光度计（岛津），２０１０ＡＨＴ型高效液相色谱仪（岛津），ＤＺ４４０型真空干燥箱（江苏），ＣＱ２５０型超声波清洗器（上海），葡聚糖凝胶柱ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ２０。１．２　试剂与药材　中药材芦荟为市售品，芦荟苷对照品（批号：０７０３９８１３）由中国药品生物制品检定所提供，乙腈为色谱纯，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。２　方法与结果　２．１　提取工艺　根据芦荟中所含蒽醌苷类与游离蒽醌衍生物在三氯甲烷中的溶解度的不同，提取芦荟中芦荟苷并且精制、定性、定量分析。首先对芦荟粉末进行酸化，使植物体内的芦荟苷及其衍生物全部游离，然后用三氯甲烷充分提取，所剩残渣用乙醇回流提取，加氢氧化钾碱化，使蒽醌苷的钾盐在乙醇中沉淀，减压浓缩至干，即得总蒽醌苷的钾盐。加冰醋酸中和，抽滤，滤液浓缩，浓缩液加铅盐沉淀，沉淀悬浮于中，以硫化氢（Ｈ２Ｓ）脱铅，过滤，滤液ｐＨ值调至中性，蒸干，后以ｉｓｏｐｒｏＨ重［收稿日期］　２００６０６１４［作者简介］　刘玉魁（１９６５－），男，河北邯鄣人，主管药师，学士，主要从事医院药学工作。电话：[phone]。结晶，所制得的晶体为芦荟苷粗制品。最后经ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ２０凝胶柱，以葡聚糖凝胶分子筛结合层析法，以７０％甲醇溶液洗脱，最终得到淡黄色结晶，为芦荟苷精制品。以蒽醌苷的化学性质为基础，选用Ｆｅｉｇｌ反应、Ｂｏｒｎｔｒａｇｅｒｓ反应、硼砂反应，并以薄层色谱法鉴定；建立高效液相色谱法测定芦荟苷含量的方法，并计算含量。２．２　预处理　分别取中药材库拉索芦荟、好望角芦荟各约３ｇ，纯化水洗涤，粉碎，过孔径为（８５０±２９）μｍ（２号）标准筛，取其中约０．１ｇ（Ⅰ），余下粉末（Ⅱ）精密称定，粉末（Ⅱ）用５％醋酸酸化，至表面皿风干，以除去多余水分。２．３　芦荟中蒽醌类成分的鉴别反应　分别取两种芦荟的粉末（Ⅰ），加１０％硫酸水溶液５ｍＬ，置水浴中加热２～１０ｍｉｎ，趁热过滤，放冷。滤液中加入２ｍＬ乙醚，振摇，静置５ｍｉｎ。分取醚层溶液，加入５％氢氧化钠溶液１ｍＬ，振摇，醚层由黄色褪为无色，碱水层显红色。２．４　提取分离　２．４．１　粗提　将风干后的芦荟粉末，加三氯甲烷回流提取２ｈ，振摇，趁热过滤，残渣挥干三氯甲烷。将残渣置于索式提取器其中，用９５％乙醇水浴回流提取４ｈ，趁热过滤，滤纸用９５％乙醇洗涤３次，弃去滤渣，向滤液中缓慢加入５％氢氧化钾溶液，用玻璃棒搅拌，同时调节ｐＨ值至９～１０，静置３０ｍｉｎ后滤过，沉淀以９５％乙醇洗涤３次，合并洗液，置真空干燥箱中，以０．８ＭＰａ，６０～７０℃，减压浓缩至干，得总蒽醌苷的钾盐。再加入９５％乙醇，使沉淀悬浮于乙醇中，缓慢加入冰醋酸，调节ｐＨ值至中性，水浴加热，趁热抽滤，滤液浓缩，浓缩液加醋酸铅试液，振摇混匀，待沉淀不再继续出现，滤过，沉淀以蒸馏水冲洗３次。将沉淀悬浮于水中，以Ｈ２Ｓ脱铅，过滤，滤液用１％氢氧化钠调ｐＨ值至中性，以ｉｓｏｐｒｏＨ重结晶，冰浴滤过，所得晶体为粗制芦荟苷。２．４．２　精制　将所得晶体溶解于７０％甲醇中，溶液上ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ２０凝胶柱层析，以７０％甲醇洗脱，分段收集。所洗脱依次得到：芦荟大黄素双葡糖苷、大黄酚葡糖苷、芦荟苷。后段收集淡黄色结晶，减压浓缩至干，即得到精制芦荟苷结晶。２．５　定性鉴别　２．５．１　Ｆｅｉｇｌ反应　取精制芦荟苷的水溶液１滴，加入２５％碳酸钠水溶液、４％甲醛溶液及５％邻二硝基苯溶液各１滴，混合·３１４·医药导报２００７年４月第２６卷第４期后置水浴上加热，于１～４ｍｉｎ内产生显著紫色。２．５．２　Ｂｏｒｎｔｒａｇｅｒｓ反应　取精制芦荟苷晶体，加１０％硫酸溶液５ｍＬ，置水浴上加热２～１０ｍｉｎ，放冷后，加乙醚２ｍＬ振摇，静置后分取醚层溶液，加入５％氢氧化钠水溶液１ｍＬ，振摇，醚层由黄色褪为无色，水层显红色。２．５．３　硼砂反应　取芦荟苷水溶液５ｍＬ，加硼砂０．２ｇ，加热溶解，取溶液数滴，加入蒸馏水１０ｍＬ，水中可见绿色荧光。２．５．４　薄层色谱　取精制品芦荟苷约１０ｍｇ，加甲醇２０ｍＬ，超声波振荡３０ｍｉｎ０作为供试溶液，另取芦荟苷对照品，加甲醇制成每１ｍＬ含５ｍｇ的溶液，作为对照品溶液。照《中华人民共和国药典》薄层色谱法［１］实验，吸取上述两种溶液各５μＬ，分别点于同一硅胶Ｇ薄层板上，以醋酸乙酯甲醇水（５１．５０．７）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以１０％氢氧化钾甲醇溶液，置紫外光灯（３６５ｎｍ）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图１。图１　芦荟薄层色谱图　１．芦荟苷对照品；２．样品２．６　含量测定　２．６．１　色谱条件　色谱柱：ＬｉｃｈｒｏｓｐｅｒＣ１８（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ）流动相：乙腈水（２５７５）；流速：１．０ｍＬ·ｍｉｎ１；柱温：２５℃；检测波长：３５５ｎｍ；进样量：１０μＬ。理论板数按芦荟苷计算不低于５０００。２．６．２　对照品溶液的制备　精密称取芦荟苷对照品０．０１００２ｇ，置５０ｍＬ的容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。２．６．３　供试品溶液的制备　取芦荟０．２ｇ，芦荟精制品０．１ｇ，精密称定，置１００ｍＬ容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。２．６．４　系统适应性　取样品溶液、对照品溶液各１０μＬ，加入液相色谱仪。图谱见表２。图２　对照品和样品的ＨＰＬＣ图　Ａ．对照品　　Ｂ．样品１．为芦荟苷２．６．５　线性关系考察　精密吸取芦荟苷对照品溶液，分别进样２，５，１０，１５，２０μＬ测定，测得芦荟苷不同进样量的峰面积。以峰面积积分值（Ｙ）与对照品进样量（Ｘ）进行线性回归，得回归方程：Ｙ＝１．２９５×１０６Ｘ－１．６１８×１０５，ｒ＝０．９９９７（ｎ＝５）。结果表明：芦荟苷进样量在０．４００８～４．００８０μｇ范围内，线性良好。２．６．６　精密度实验　精密吸取同一对照品溶液，重复进样５次，测得峰面积值并计算。结果表明精密度良好，ＲＳＤ为０．７％。２．６．７　重复性实验　取同一个样品，按上述测试条件测定并进行计算，结果表明重复性良好，测得６次含量为２０．１％，ＲＳＤ为１．１％。２．６．８　稳定性实验　分别取同一供试品溶液，每隔２ｈ进样测定峰面积，结果表明供试品溶液１０ｈ内稳定。ＲＳＤ值为０．８％。２．６．９　加样回收率实验　取已知含量的样品，分别精密加入芦荟苷对照品溶液，配制供试液，按上述测试条件测定并进行计算。测得的平均加样回收率为９９．７％，ＲＳＤ为１．３％（ｎ＝６）。２．６．１０　样品测定　取芦荟按上述色谱条件和方法进行测定，以芦荟苷计算，库拉索芦荟中芦荟苷含量２５．５％，好望角芦荟中芦荟苷含量２０．１％（ｎ＝２）。３　讨论　一般羟基蒽醌类衍生物及其相应的苷类在植物体内多通过羟基或羟基结合成镁、钾、钠、钙盐形式存在，为充分提取出蒽醌类衍生物杂质，必须预先加醋酸酸化使之全部游离后再进行提取。在实验中，由于蒽醌苷在水中溶解度大大降低，所以在分离滤液过程中常采取趁热过滤的方式。而在ｉｓｏｐｒｏＨ重结晶后，需采用冰浴措施。这些都是提高收率减少误差的方法。另外，在通入硫化氢脱铅的过程中，一定要反应充分，否则会有芦荟苷与铅形成的络合物残留在沉淀中而丢失，将给精制品带来重大影响［２～９］。笔者曾采用紫外分光光度法测定含量，但考虑杂质的影响，后采用ＨＰＬＣ测定药用植物芦荟中芦荟苷的含量，且方法简便、快捷、避免其他杂质干扰，预处理后直接进样，色谱峰分离度好，精密度与回收率符合要求。该法为开发我国芦荟资源且进一步对芦荟苷的研究提供了可行性。［参考文献］［１］　国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）［Ｚ］．北京化学工业出版社，２００５：１１２－１１３．［２］　包国荣，陈　丹，张东升，等．芦荟苷的含量测定方法比较研究［Ｊ］．药物分析杂志，１９９７，１７（５）：３３８－３３９．［３］　徐礼桑．中草药有效成分分析法（上册）［Ｍ］．北京：人民卫生出版社，１９８４：１２０．［４］　吴立军．天然药物化学［Ｍ］．北京：人民卫生出版社，２０００：４４．［５］　中国药科大学．中药辞海（第２卷）［Ｍ］．北京：中国医药科技出版社，１９９５：１２４．［６］　郭素华，邓思珊，陈志春，等．芦荟原胶中芦荟苷的含量测量［Ｊ］．福建中医学院学报，１９９４，４（１）：３６－３７．［７］　陈立明，夏恒建，熊富良，等．通便胶囊中芦荟苷的含量测定［Ｊ］．中成药，１９９７，１９（７）：１０－１１．［８］　崔　征．生物学［Ｍ］．北京：中国医药科技出版社，１９９９：２６５．［９］　张继杰．中药化学［Ｍ］．北京：人民卫生出版社，１９９３：１１５．·４１４·ＨｅｒａｌｄｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅＶｏｌ２６Ｎｏ４Ａｐｒｉｌ２００７