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酶的生产方法提取分离法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化学合成(chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea……organ/tissue/cellAmylasefromBacillusProteasefromBacillusPhosphatasefromBacillusGlucoamylasefromAspergillus……PlantcellcultureAnimalcellcultureFewexample第二节药用酶的生产技术一、酶生物合成过程及其调节二、常见产酶微生物三、酶的发酵工艺条件及控制4、酶生产过程的动力学GoGoGoGo5、动植物细胞培养产酶，自学一、酶的生物合成及其调节1、中心法则-CentralDogma2、RNA的生物合成-Transcription3、蛋白质的生物合成-Translation4、酶生物合成的调节-RegulationGoGoGoGoReversetranscription1、中心法则-CentralDogmaReplication复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。Transcription转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。Translation翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的AA顺序的过程。Reversetranslation逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。2、RNA的生物合成(转录)-Transcription细胞内RNA的生物功能(1)在某些RNA病毒中，其所含的双链RNA作为遗传信息的载体。(2)在蛋白质的生物合成过程中，各种RNA起着重要的作用。其中，tRNA作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别mRNA分子上的密码子；mRNA作为蛋白质合成的模板，由其分子上的三联体密码控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序；rRNA与蛋白质一起组成核糖核蛋白体（核糖体），作为蛋白质生物合成的场所。(3)某些RNA具有生物催化活性，属于核酸类酶，在一定条件下，可以催化有关的生化反应。(4)各种小分子RNA在分子修饰和代谢调节等方面有重要作用。转录过程的特点1、转录的不对称性：在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。反义链antisensestrand（无意义链，负链）：在RNA的转录中，用作模板的DNA链称为反义链。有义链codingstrand（编码链，正链）：在RNA的转录中，不作为模板的DNA链称为有义链。2、转录所需酶：依赖DNA的RNA聚合酶又称为转录酶，是以DNA为模板的一类RNA聚合酶。在原核生物和真核生物中，转录酶有所不同。原核生物的转录酶比较简单，由1种RNA聚合酶催化所有RNA的生物合成。而在真核生物中RNA聚合酶有3种，分别为RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ，它们都属于寡聚酶，酶的亚基数目为4～10个，亚基种类有4～6种。转录过程起始位点的识别recognition转录起始initiation链的延伸elongation转录终止termination转录后加工modificationTheE.coliRNApolymeraseholoenzymeconsistsofsixsubunits:a2bb’s.PossiblecatalyticsubunitsPromoterspecificityEnzymeassembly,promoterrecognition,activatorbindingRoleunknown(notneededinvitro)36.5kDa15115511kDa(32-90kDa)3、蛋白质的合成(翻译)-Translation翻译:以RNA中mRNA为模板,按照其核苷酸顺序所组成的密码指导蛋白质的合成的过程.mRNA蛋白质翻译各种信息各种蛋白质（核苷酸排列顺序）（氨基酸排列顺序）蛋白质合成的几个要素(1)-mRNA(模板)mRNA是带有DNA遗传信息指导蛋白质合成的直接模板。以mRNA为模板,合成一定结构的多肽链的过程(翻译)，就是将mRNA分子中的核苷酸排列顺序转变成蛋白质分子中的氨基酸排列顺序。蛋白质合成的几个要素(2)-遗传密码mRNA分子中,每三个相邻的核苷酸组成的三联体代表某种氨基酸或其它信息，称为密码子或三联密码。四种核苷酸编成三联体可形成43个即64个密码子。其中：一个起始密码:AUG三个终止密码:UAAUGAUAG多数氨基酸拥有2-4个密码蛋白质合成的几个要素(3)-转运RNAtRNA是氨基酸的转运工具，携带活化的氨基酸到核蛋白体。tRNA有特异性，至少有20种以上。每种tRNA的反密码环顶端均有由三个核苷酸组成的反密码，能与mRNA上相应的密码互补结合。酪5’5’3’AUGGUUUACACA酪氨酰-tRNA反密码mRNA密码(codon)与反密码(anticodon)的碱基配对蛋白质合成的几个要素(4)-核糖体核糖体（或称核糖核蛋白体）由蛋白质和rRNA组成。是存在于细胞质内的微小颗粒。Theribosomecompositionofprokaryoticandeukaryoticcell蛋白质的合成过程肽链合成的起始肽链合成的延伸肽链合成的终止与释放合成多肽的输送和加工蛋白质分子的折叠高效率的蛋白质合成体系4、酶生物合成的调节(regulation)基因水平的表达控制酶含量的调节操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。酶在细胞内的含量取决于酶的合成速度和分解速度。细胞根据自身活动需要，严格控制细胞内各种酶的合理含量，从而对各种生物化学过程进行调控。酶浓度调节的化学本质是基因表达的调节。在细胞内，所合成的酶的种类及数量是由特殊的基因信息决定的。DNA所携带的酶蛋白遗传信息，需要通过转录和翻译而合成酶蛋白。在细胞内进行的转录或翻译过程都有特定的调节控制机制，其中转录的调控占主导地位。因此，基因表达的调控主要在转录水平上进行。本世纪三十年代，H.Karstrom在对糖代谢过程中的某些酶的合成进行研究时提出：诱导酶与组成酶。(1)、原核生物中酶生物合成的调节(regulation)原核生物中酶生物合成的调节主要是转录水平的调节，又称基因的调节。该理论最早由JacobandMonod提出。根据这一理论，在DNA分子中，与酶的生物合成有密切关系的基因有四种：调节基因、启动基因、操纵基因和结构基因。操纵基因可以与调节基因产生的变构蛋白（阻遏蛋白）中的一种结构结合，从而操纵酶生物合成的时机和合成速度。启动基因决定酶的合成与否，它由两个位点组成：一个是RNA聚合酶的结合位点，另一个是环腺苷酸（cAMP）与环腺苷酸受体蛋白（CAP）组成的复合物的结合位点。结构基因与操纵基因、启动基因一起组成操纵子。原核生物中主要有两种类型：诱导型和阻遏型。诱导型操纵子：在无诱导物存时，其基因表达水平很低或不表达，只有在诱导物存在的条件下，才能转录生成mRNA，进而合成酶，如乳糖操纵子等。阻遏型操纵子：在无阻遏物存在下，基因正常表达，当有阻遏物存在时，转录受阻，如色氨酸操纵子等。另外，启动基因位点上cAMP-CAP复合物的结合与否，亦对酶的生物合成起到调节作用。转录水平的调节主要有三种模式：分解代谢物阻遏作用、酶合成的诱导作用和酶合成的反馈阻遏作用。①分解代谢物阻遏作用分解代谢物阻遏作用是指某些物质经过分解代谢产生的产物阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。原因：易分解物经过分解产生ATP，消耗掉AMP，进而消耗cAMP，同时腺苷酸环化酶的活化受到抑制而使cAMP的合成受阻，从而导致cAMP的浓度降低。这必然导致cAMP-CAP复合物的浓度随之降低，结果启动基因的相应位点上没有足够的cAMP-CAP复合物结合，RNA聚合酶也就无法结合到启动基因的相应位点上，转录无法进行，酶的生物合成受到阻遏。②酶合成的诱导作用：加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速进行的过程，称为酶生物合成的诱导作用（简称诱导作用）。酶合成诱导的现象—JacobandMonod的工作：已知分解利用乳糖的酶有：b-半乳糖苷酶；b-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：a.大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；b.大肠杆菌生长在唯一碳源乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；当换成葡萄糖培养基时，三种酶基本消失；c.表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。某些代谢物可以诱导某些酶的合成，是通过促进为该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成的诱导。能诱导酶合成的物质叫诱导物。被诱导合成的酶叫诱导酶。细菌乳糖操纵子的作用机制(降解物阻遏)调节基因启动子操纵基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMP复合物mRNA当葡萄糖作唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶有抑制作用，则cAMP的浓度降低，CAP-cAMP复合物减少，不能与启动子结合，故转录不得进行。+b-半乳糖苷酶b-半乳糖苷透过酶b-半乳糖苷乙酰基转移酶酶过去称葡萄糖效应乳糖操纵子的结构诱导机制③酶合成的反馈阻遏作用（又称产物阻遏作用）：是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的过程。引起反馈阻遏作用的物质称为共阻遏物。酶合成阻遏的现象—JacobandMonod的工作：实验：1.大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；2.在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。3.表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌生长的经济原则：不需要就不合成。某些代谢物可以阻止某些酶的合成，是通过阻止为该酶编码的基因的表达而进行的，这种现象叫做酶合成的阻遏。能阻遏酶合成的物质叫辅阻遏物。被辅阻遏物作用而停止合成的酶叫阻遏酶。调节基因操纵基因结构基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达调节基因操纵基因结构基因辅阻遏物trp代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基因不能表达色氨酸操纵子（酶的阻遏）----------阻遏物和操纵基因的调节(2)、真核生物合成的调节真核生物比原核生物的结构复杂，其基因的表达和调控亦复杂得多，目前尚无统一的理论和模型来阐述真核生物中酶生物合成的调节规律。①细胞分化改变酶的生物合成（参见P187）②抗原诱导抗体酶的生物合成（参见P188）二、药用酶生产细胞的选择基本要求：不是致病菌发酵周期短,产酶量高不易变异退化最好是产生胞外酶的菌种,利于分离。对医药和食品用酶,还应考虑安全性：凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶,安全!由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。（一）微生物(1)大肠埃希氏杆菌，简称为大肠杆菌，是最为著名的原核生物。形态：短杆或长杆状，0.5～1.0×1.0～3.0um，革兰氏阴性，运动(周毛)或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。应用：大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等(2)醋酸杆菌（Acetobacter）菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。应用：有机酸(食醋等）葡萄糖异构酶(高果糖浆)山梨糖(维C