基因重组技术

基因重组技术几个重要的专业名词重组DNA技术（recombinantDNAtechnique），在体外通过末端共价连接重新组合脱氧核糖核酸（DNA）分子，使它们能在适当的细胞中增殖的遗传操作。这种操作可把特定的基因组合到载体上，并使之在受体细胞中增殖和表达。遗传工程(Geneticengineering)就是按人们的意思去改造生物的遗传特性、或创建具有新遗传物性的生物。遗传工程广义包括细胞水平上的遗传操作（细胞工程）和分子水平上的操作，即重组DNA技术（有人称之为基因工程）基因工程中最主要的工作是分子克隆（molecularcloning）分子克隆所谓克隆，是指一个细胞经过无性繁殖以后所形成的子代群体。纯化繁殖DNA就称为DNA克隆（分子克隆）分子克隆—制备DNA片段，在体外将目的基因与载体DNA结合成一个具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、获得大量同一DNA分子拷贝。重组DNA技术←→分子克隆技术分子克隆所采用的技术：重组DNA技术重组DNA技术流程一般包括四个步骤①产生DNA片段（目的基因的获得）；②DNA片段与载体DNA分子相连接；③将重组DNA分子导入宿主细胞；④选出含有所需要的重组体DNA分子的宿主细胞。目的基因载体DNA(限制性内切酶切开)宿主细胞重组体已转化的宿主细胞繁殖阳性克隆株表达基本工程的基本程序基因重组所必需的元素及过程1目的基因2载体3工具酶4宿主细胞一、目的基因序列的来源构建基因组DNA文库构建cDNA文库PCR扩增化学人工合成必需的元素及过程（一）、构建基因组DNA文库用物理方法或酶法将基因组DNA降解成预期大小的片段，然后与载体（噬菌体、粘粒或YAC载体）连接，转入受体细菌或细胞。每一个细胞接受了一个重组DNA分子，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）。（二）、cDNA文库构建提取组织细胞的总mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（噬菌体或质粒载体）连接后转化细菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。(三)、聚合酶链式反应（PCR）如果已经知道目的基因的序列，就能很方便地用聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR），从基因组DNA或cDNA中获得目的基因，而不必要经过复杂的DNA文库构建过程。(四)、人工化学合成现在计算机控制的全自动核酸合成仪已被广泛应用，按人们设计好的序列一次合成100-200bp长的DNA片段已不成问题。可用这些合成的片段组合连接成完整的基因。载体是指能将外源DNA携带进入宿主细胞并进行扩增和表达的工具。分离的基因和核酸序列自身不能繁殖，需要载体携带它们到合适的细胞中复制和表现功能。基因工程载体一般要求:①能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。二载体必需的元素及过程③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。④容易从宿主细胞中分离纯化出来，这才便于重组操作。⑤有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。载体分类按功能①克隆载体（目的基因拷贝）；②表达载体（基因表达产物）按宿主细胞①原核载体；②真核载体；③穿梭载体（携带两种宿主复制子，能在两种生物体内复制。）常用的载体有质粒、噬菌体和病毒载体①质粒（plasmid）细菌细胞基因组外的共价闭合环状双链DNA分子，能自主复制，能与细菌共生的遗传成分。②噬菌体（phage）感染细菌的一类病毒，有的基因组较大，例如λ噬菌和T等；有的则较小，如M13、f1、fd等。③动物病毒（virus）质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。⒈质粒载体细菌等宿主细胞中染色体以外的环状双链DNA分子。大小为1～200kb;能独立于宿主染色体外进行自我复制，每个细胞中可含10～200个拷贝。构建的质粒载体应具有复制起始点(ori)、1~2选择标记基因(Ampr、kana+)以及允许外源DNA组入的多个克隆位点（MCS）。①比15kb小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。②能自主复制，只有ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制。③质粒对宿主生存并不是必需的。复制起始点选择标记基因多克隆位点（MCS）。质粒载体的优缺点⑴优点——易操作，用途广⑵缺点——容量小，化学法的转化率低⒉噬菌体载体一种细菌病毒，可作为克隆载体。优点：可以在体外包装产生感染性很高的噬菌体颗粒。DNA蛋白质头部尾部尾丝噬菌体（phage）是感染细菌的一类病毒。用感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。λ噬菌体由头和尾构成，基因组是长约49kb的线性双链DNA分子，组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。λ噬菌体感染时，通过尾管将基因组DNA注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。①溶菌性方式（lyticpathway）：λDNA上基因表达出构成噬菌体头、尾和尾丝所需的各种蛋白质，λDNA复制合成许多子代λDNA，装配成许多子代的λ噬菌体，最后裂解细菌，释放出许多新的λ噬菌体。②溶原性方式（lysogenicpathway）：进入细菌的λDNA可整合入细菌的基因组DNA中，随细菌染色体DNA复制，传给细菌后代，这个整合在细菌基因组DNA中的λDNA称为原噬菌体(prophage)，含有原噬菌体的细菌称为溶源菌.噬菌体两种不同的方式繁殖双链DNA，滚环复制。溶源性（温和phage）——感染细菌后，整和到细菌染色体溶菌性（烈性phage）——感染后大量复制，细菌死亡破裂。感染溶源条件诱导溶菌用作克隆载体的噬菌体λ噬菌体和M13噬菌体噬菌体载体的优缺点⑴优点——容量大，转染频率高，筛选方便⑵缺点——操作困难（需体外包装，CsCl2超速离心），保存困难（滴度下降）⒊病毒载体病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中，使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用的有改造来自猴肾病毒SV40（SimianVirus40）、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，其目的为将目的基因或序列导入动物细胞中表达进行功能研究、或用作基因治疗等。三、工具酶一般分四类：①核酸酶（切割和裂解）②连接酶③聚合酶④修饰酶必需的元素及过程1.核酸酶核酸酶可分为两类：核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸链切断。命名规则第一个字母（大写）是细菌属名的第一个字母，第二、三个字母小写，该酶来源的细菌种名英文的前2个字母第四个字母大写表示不同的变种/品系小写表示不同的菌株和型其后再按发现的先后写上罗马数字例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilusinfluenzaed）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。限制性核酸内切酶分类：按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断核酸的情况不同，分为三类：Ⅰ、Ⅱ和ⅢⅠ类限制性核酸内切酶由3种不同亚基构成，兼有修饰酶活性，随机切割在识别位点1000bp以外的DNA序列。Ⅱ类限制性核酸内切酶只由一条肽链构成，切割DNA特异性最强，在识别位点范围内切断DNA。通常在重组DNA技术使用的限制性核酸内切酶Ⅲ类限制性核酸内切酶由两种不同的亚基组成，兼有内切酶活性和修饰酶活性，切割位点在识别序列周围25-30bp范围内。★其中Ⅱ型酶，由于其核酸内切酶活性和甲基化作用活性是分开的，并且核酸内切作用具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。Ⅱ型酶的特点识别序列特异；切割方式特异⑴识别序列4-6碱基对，识别序列往往是旋转对称，迴文结构的双链DNA5’…G↓AATTC…3’3’…CTTAA↑G…5’⑵切割方式平末端和粘末端⑶同裂酶识别位点相同，切割位点不同或相同⑷同尾酶来源不同，识别序列不同，但产生的粘性末端相同限制性核酸内切酶识别和切割的三种情况：①产生5’粘性末端（cohesiveend）:以EcoRⅠ为例：5’-G↓AATTC…3’→5’-GpOHTTAAC-3’3’-CTTAA↑G…53‘-CTTAAOHpG-5'②产生3’粘性末端：以PstⅠ为例：5’…CTGCA↓G…3’→5’…CTGCApOHG…3’3’…G↑ACGTC…5’3’…GOHpACGTC…5③产生平末端（bluntend）:NruⅠ为例：5’…TCG↓CGA…3’→5’…TCGpOHCGA…3’3’…AGC↑GCT…53’…AGCOHpGCT…5’星活性（staractivity）——非最适条件下酶的识别特异性降低，产生非特异的切割现象。引起Star活性的原因1.较高的甘油浓度(5%v/v)。2.酶与底物DNA比例过高(不同的酶情况不同，通常为100U/μg)。3.低盐浓度(25mM)。4.高pH值(pH8.0)。5.存在有机溶剂(如DMSO、乙醇、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等)。6.用其他二价离子替代镁离子。Star活性是内切酶的一种普遍现象，但是大多数可以控制，正常情况下使用提供的缓冲液就不会出现Star活性。抑制Star活性的方法1.尽量使用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。2.尽量避免有机溶剂(如制备DNA时引入的乙醇)的污染。3.将离子浓度提高到100～150mM(若酶活性不受离子强度影响)。4.将反应缓冲液的pH值降到7.0。5.二价离子使用Mg2+。内切酶使用注意事项⑴选择正确的酶⑵酶的保存50%甘油-20℃，-70℃（长期保存）⒉连接酶T4连接酶的功能催化双链DNA一端3’-OH与另一双链DNA的5’磷酸根形成3’，5’磷酸二酯键。5’…CTGCApHOG…3’3’…GOHpACGTC…55’…TCGpHOCGA…3’3’…AGCOHpGCT…5①间断修复②连接功能连接酶的特性催化粘末端平末端双链DNA分子间⒊聚合酶⑴DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ、Klenow、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、反转录酶、末端转移酶⑵RNA聚合酶T7、T3、SP6⒋修饰酶⑴碱性磷酸酯酶催化DNA双链分子5’端脱磷酸CIP（小牛碱性磷酸酶）⑵多核苷酸激酶在5’端—OH加磷酸四目的基因与载体的连接将目的基因或序列插入载体，主要靠DNA连接酶和双链DNA粘末端单链序列互补结合的配合使用。⑴粘性末端连接⑵平末端连接⑶利用人工接头连接⑷加入同聚体尾连接必需的元素及过程粘性末端连接Directionalcloning平末端连接可先连上人工设计合成的脱氧寡核苷酸双链接头，使DNA末端产生新的限制内切酶位点，经内切酶割后，即可按粘性末端相连。T4DNA连接酶也能催化限制性内切酶切割产生DNA平末端的连接。利用人工接头连接利用人工街头进行连接AA+3’3’针对PCR产物的T-A克隆五、宿主细胞⑴常用的宿主细菌（质粒载体）DH系列DH1DH10BJM系列JM101JM109HB101、C600等特点：野外生存能力差，是重组缺陷型必需的元素及过程⑵重组DNA导入细胞转化transformation：将质粒DNA或其它外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。宿主细胞：大肠杆菌感受态细胞的制备：冷Cacl2处理转化操作：外源DAN与感受态细胞混合后置冰上30分钟→→42℃，90秒→→冰上2分钟→→不含抗生素的培养基培养1小时→→接种含有关抗生素的琼脂平板感染infection以真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，必须在体外经过包装成具有感染能力的病毒，才能用来感染适当的细胞并在细胞内扩增。转染重组体导入真核细胞的过程；转导以噬菌体作载体