低温胁迫对大叶秦艽可溶性糖、脯氨酸、丙二醛含量的影响

毕业论文题目：低温胁迫对大叶秦艽可溶性糖、丙二醛、脯氨酸含量的影响姓名：熊鹏学号：0715205002指导教师：李小安专业年级：环境科学2007级所在学院和系：生物科学系完成日期：2011年5月31日答辩日期：2011年6月13日低温胁迫对大叶秦艽可溶性糖、丙二醛、脯氨酸含量的影响熊鹏（青海大学生物科学系,青海西宁,810016）摘要试验以大叶秦艽为研究对象，将大叶秦艽植株置于4℃条件下生长，培养时间分别为24、48、72小时。研究低温胁迫下大叶秦艽可溶性糖、脯氨酸、丙二醛含量的变化。结果表明：大叶秦艽的可溶性糖含量随着低温胁迫时间的增加而逐渐增加；丙二醛和脯氨酸的含量随着低温胁迫时间的增加而出现升—降—升的变化规律。关键词：大叶秦艽，脯氨酸，丙二醛，可溶性糖，低温胁迫LowTemperatureStressonProlineGentianamacrophylla,MDAandSolubleSugarContentXiongPeng(DepartmentofbiologyScience,Qinghaiuniversity,Xining,810016)AbstractGentianamacrophyllaexperiment,astheresearchobject,theplantsofGentianamacrophyllagrowingat4℃conditions,trainingtimewas24,48,72hours.StudyunderlowtemperaturestressofGentianamacrophyllasolublesugar,proline,MDAchanges.Gentianamacrophyllaresultsshowedthatthesolublesugarcontentincreasedwiththeincreaseoflowtemperaturestressoftimeandgraduallyincrease;MDAandprolinecontentincreasedwithtimeofcoldstressappearsup-down-upwerestudied.Keyword:GentianamacrophyllaProline，MDA，Solublesugar，LowTemperatureStress目录1绪论..............................................................................12材料与方法........................................................................22.1试验材料......................................................................22.2材料处理......................................................................22.3.1测定项目.................................................................22.3.2测定方法.................................................................22.3.3数据处理.................................................................33结果与分析........................................................................33.1可溶性糖含量在低温胁迫下的变化................................................33.2丙二醛含量在低温胁迫下的变化..................................................43.3脯氨酸含量在低温胁迫下的变化..................................................54讨论..............................................................................64.1低温胁迫对大叶秦艽可溶性糖含量的影响..........................................64.2低温胁迫对大叶秦艽丙二醛含量的影响............................................64.3低温胁迫对大叶秦艽脯氨酸含量的影响............................................65结论..............................................................................7参考文献...........................................................................9致谢..............................................................................111绪论青海大学生物科学系11绪论温度是影响植被分布的主要生态因子之一，区域植被类型分布格局是长期对温度和热量环境适应的结果。大叶秦艽若要大面积种植，需要考虑对引进地温度和热量因子的适应。我国青藏高原地势高,气候严寒,自然条件十分严酷,寒冷的气候条件使各种草本植物均受到不同程度寒害的影响,对大叶秦艽等具有经济价值的植物生存以及潜在产量和品质特性的发挥都有很大威胁。通过研究筛选抗寒性较强，适宜该地区种植的大叶秦艽种质资源，对该区域农村经济、产业结构调整和生态环境保护具有重要意义。大量研究表明，低温胁迫可使像大叶秦艽(GentianamacrophyllaPall)这类龙胆科(Gen-tianaceae)植物积累更多的脯氨酸、丙二醛、可溶性糖[1]等。这些物质的大量积累可降低组织和细胞的冰点温度，使细胞的水合度增大，保水能力增强，避免原生质在低温下的脱水伤害；也是越冬植物的重要能量和更新芽的萌动力，与大叶秦艽的抗寒性密切相关[1-2]。植物的抗寒性还与植物体内保护酶系统的活性和膜脂过氧化程度密切相关，保护酶活性高的植物品种对环境反应快，抗氧化能力强，抗寒性也强。秦艽又称大叶秦艽(GentianamacrophyllaPall),为龙胆科(Gen-tianaceae)多年生草本植物,是我国传统常用中药材,也是国家重点保护的野生药材之一,主要分布在陕西西部和甘肃东部地区[3].其以根入药,有祛风湿,清湿热,止痹痛之功效[4]。化学成分为环烯醚萜甙类,主要是龙胆苦甙、秦艽甙等生物碱[4,5],对风湿性关节炎有显著的作用,对真菌也有明显的抗性[6].2000年版中华人民共和国药典中规定,我国现在使用的中药秦艽的4种原植物分别是大叶秦艽(GentianamacrophyllaPall)、粗茎秦艽(GentianacrassicaulisDuthieexBurk.)、麻花秦艽(GentianamacrophyllaPall)和小秦艽(GentianadahuricaFisch)[4].传统认为这4种秦艽中,大叶秦艽的药用品质最佳[7]而且历代草本记载的中药秦艽只有大叶秦艽这一种[3].由于秦艽是中药材商品生产的优势资源之一,国内外市场需求逐年增加,加之乱采乱挖,使其野生资源日益枯竭,应用组织培养方法繁殖和保护野生的药用植物秦艽种质已成为当务之急.目前,在对大叶秦艽的研究中只对其化学成份，药用有效成分研究较多较完善系统，而对大叶秦艽在低温环境下生长其生理特性变化研究几乎是空白。大叶秦艽作为一种中国传统中药材，近年来受到越来越多的关注。由于近年来临床用药量的增加与多年的过度采挖,造成了目前大叶秦艽资源匮乏的现状，研究植物在不良环境下生命活动的规律，不仅有利于全面和彻底地了解植物的正常生理活动，而且对提高植物生产力、保护环境也具有重要的指导作用。因此，通过对大叶秦艽在低温胁迫下与室温下的可溶性糖、丙二醛、脯氨酸含量的对比研究，可以在低温条件下根据不同品种的大叶秦艽体内的可溶性糖、丙二醛、脯氨酸等含量的变化规律判别不同品种大叶秦艽的抗寒性强弱，筛选出抗寒性较强的品种在青藏高原上种植。还可以根据大叶秦艽体内的可溶性糖、丙二醛、脯氨酸等这些物质的含量受低温影响的变化规律，在低温来临前通过人为增施一些物质．提高细胞内此类物质的含量以增加大叶秦艽的抗寒性，降低因低温带来的冻害或冷害损失。青海大学本科毕业论文：低温胁迫对大叶秦艽可溶性糖、丙二醛、脯氨酸含量的影响2青海大学生物科学系2材料与方法2.1试验材料大叶秦艽（无菌培养）由何涛老师提供。2.2材料处理将上述培养好的大叶秦艽植株置于4℃低温下光照培养，培养时间分别为24、48、72小时。处理后的材料分别进行可溶性糖、丙二醛、脯氨酸含量测定，每个实验重复3次。2.3测定项目与方法2.3.1测定项目测定项目包括：可溶性糖、丙二醛（MDA）、脯氨酸的含量。2.3.2测定方法（1）可溶性糖含量采用苯酚法测定[8]，取4℃、25℃下处理过的大叶秦艽新鲜叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，在研钵中进行研磨，研磨成匀浆。称取0.10～0.30g，共3份，或干材料。分别放入3支刻度试管中，加入5～10mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。吸取0.5mL样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚，浓硫酸溶液，显色并在485nm波长下测定吸光度，求出大叶秦艽可溶性糖的含量。图1为可溶性糖含量的标准曲线,该曲线的相关系数为0.954，说明本次的测定方法准确可行，可以作为后面实验的标准曲线。图1可溶性糖含量的标准曲线Fig.1standardcurveofSolublesugar可溶性糖标准曲线00.20.40.60.811.21.41.610204060浓度（mg/g）吸光值80Y=0.018X+0.007R2=0.9543结果与分析青海大学生物科学系3(2)丙二醛的含量取4℃、25℃下处理的大叶秦艽不同部位的叶片，洗净擦干，剪成0.5cm长的小段，称2g叶片，加入5mL磷酸缓冲液（50mmoL，pH值为7.8）及少量石英砂，于冰浴中研磨提取，匀浆液以12000g离心力作用下（4℃）离心10min，其上清液即为MDA提取液，取1mLMDA提取液，加3mL27％三氯乙酸和1mL2%TBA。混和液在95度水浴中保温30min后，立即置于冰浴中冷却，然后离心10min，于波长532nm和600nm下测定其吸光值，求出大叶秦艽丙二醛的含量。（3）脯氨酸的含量采用茚三酮显色法测定[8-9]，称取0.20g鲜叶，剪碎置于具塞试管中，加3％的磺基水杨酸溶液5mL，沸水浴中浸提10min，冷却至室温，取上清液2mL，加2mL冰乙酸和2.5％酸性茚三酮显色液3mL，沸水浴中显色40min，冷却，用5mL甲苯萃取，测定520nm波长下的吸光度。先建立脯氨酸含量的标准曲线，再测定低温胁迫下大叶秦艽植株的脯氨酸含量。图2为脯氨酸的标准曲线：图2脯氨酸含量的标准曲线Fig.2standardcurveofprolinecontent2.3.3数据处理所得试验数据用Excel数据处理软件进行处理。3结果与分析3.1可溶性糖含量在低温胁迫下的变化大叶秦艽植株在4℃下胁迫24、48、72h，植株叶片中可溶性糖含量变化如图3所示：脯氨酸含量的标准曲