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ProtocolNo.PT140726-1GenlociClassicCRISPR-Cas9内部操作流程GenlociClassicCRISPR-Cas9内部操作流程未来的中国科学家们，加油！ProtocolNo.PT140726-1GenlociClassicCRISPR-Cas9内部操作流程1，CRISPR-Cas9基因编辑实验流程图如下：pGK1.1设计2条单链oligo序列；退火形成双链DNA。将双链DNA连接到载体中。转化G10CompetentCell；筛选阳性克隆；测序验证序列；质粒大提；电转染靶细胞。在细胞内crRNA识别靶位点，Cas9对靶位点进行随机剪切。CruiserTM酶切细胞池，计算突变率；CruiserTM酶切初筛阳性克隆；将阳性克隆测序验证；做敲除序列比对分析。U6CACCGCAAA123455’-5’3’-3’--～20bpProtocolNo.PT140726-1GenlociClassicCRISPR-Cas9内部操作流程2，操作步骤实验前，请您务必做好以下验证实验：A．单细胞生长情况，确保单个细胞可以正常生长形成单克隆，即，低密度的细胞在培养皿中可以形成单克隆。B．目的基因的表达情况分析，为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要PCR扩增靶基因，并对PCR结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用RT-PCR分析靶基因的活跃度。1.设计OligoDNA序列首先，您需要在靶标DNA区域中设计一对20bp左右的oligoDNA，您可以通过以下在线工具设计：●麻省理工学院的CRISPRDesign：●德国癌症研究中心的E-Crisp：下面我们选择麻省理工学院的CRISPRDesign工具来做设计举例，以Fut8基因为例，一次只能输入大小为23～250bp的基因片段，最好一次只输入一个外显子，避免Guide序列跨内含子的。点击“Downloadasgenbank”按钮，出现以下界面：“Fut8”根据左边的score的高低选取合适的Guide序列，以Guide#1序列为例，2条单链oligo的序列如下（红色字体部分是要与BbsI酶切后的载体相互补的部分）：Fut8-F:caccGAATGAGCATAATCCAACGCCFut8-R:aaacGGCGTTGGATTATGCTCATTC※注意：oligoDNA设计序列的第一个碱基必须是G，如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是G，可自行加一个G上去。另外，需在位点上下游各设计一条引物，用于后续PCR或测序检测阳性克隆，引物能扩增约300bp的DNA片段，上游引物距突变位点约100bp，下游引物距突变位点约200bp。将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为PAGE。2.T4DNALigase连接将合成后的2条单链oligoDNA退火形成双链DNA，再与载体连接，pGK1.1linearvector是线性化载体，无需酶切处理，可直接用于T4DNALigase连接反应，pGK1.1载体已经优化过，其转染和敲除的效率比一般CRISPR载体更高。ProtocolNo.PT140726-1GenlociClassicCRISPR-Cas9内部操作流程退火反应体系如下：将以上体系瞬时离心后，置于PCR仪中95℃孵育3min，孵育后自然冷却20min。取1.75μl的杂交后的双链DNA进行T4DNALigase连接反应，反应体系如下：pGK1.1linearvector2μl双链DNA1.75μlT4DNALigase1μl10xT4DNALigaseBuffer1μlddH2O4.25μl10μl※注意：请您根据步骤1自行设计正链Oligo序列和负链Oligo序列，合成后的2条单链oligoDNA退火复性成双链DNA，再进行T4DNALigase连接反应。连接产物可以直接转化DH5a高效感受态细胞，转化和筛选阳性克隆的实验步骤请您参考《分子克隆实验指南》，pGK1.1的抗性为卡那霉素抗性，筛选后的阳性克隆，需测序验证序列的正确性。3.电转染靶细胞(推荐)转染前进行质粒大提，确保质粒浓度≥2μg/μl浓度，再取4～7μg进行电转染靶细胞，推荐使用Celetrix细胞电转仪(型号：CTX-1500A)，贴壁细胞的数量需1x106～3x106，悬浮细胞的数量需3x106～5x106。另外，您也可以使用转染试剂转染靶细胞。4.混合克隆pool检测48-72小时后做有限稀释，一般5块板足够，并取电转后细胞的pool1000个细胞以上离心，去上清，PBS洗一遍，细胞沉淀溶于适量的PBS中，煮5min后模板就制备好了，剩余的pool细胞冻存。PCR检测（以Fut8基因为例）：11步骤所制备的模板5ulFut8-seq-F(10mM):1ulFut8-seq-R(10mM):1uldNTPMixture(10mMeach):1ulTaq酶：0.5ul10XTaq酶buffer：5ulMgcl23ulH2O:33.5ulTotal50ul程序：95℃2mincycles1x95℃20SX℃20S72℃30S72℃5mincycles1x95℃变性5minPCR产物使用CruiserTM酶切15-20分钟，酶切产物1%-1.5%凝胶电泳。正链Oligo(100μM)0.5μl负链Oligo(100μM)0.5μlddH2O18μlAnnealingBuffer(20x)1μl20μl}cycles35xProtocolNo.PT140726-1GenlociClassicCRISPR-Cas9内部操作流程上图为混合克隆pool酶切检测，由此图可知此混合克隆pool中有敲除成功的细胞，则进行下一步并计算突变率。5.CruiserTM筛选阳性克隆将剩余的pool的靶细胞有限稀释后，分到96孔板中进行单克隆培养，如果靶细胞是悬浮细胞，推荐使用CellPlaza™(Cat.No.:GP08250)培养细胞，待细胞长好后，取1000个左右的细胞，提基因组，推荐使用GenlociTNA抽提试剂盒(Cat.No.:GL10851S)。然后使用核酸内切酶初步筛选阳性克隆，推荐使用GenlociCruiserTM突变检测试剂盒(Cat.Nos.:GCMD025,GCMD100)，对CruiserTM筛选后的阳性克隆进行测序分析，并对碱基缺失结果进行比对分析。ProtocolNo.PT140726-1GenlociClassicCRISPR-Cas9内部操作流程IV．FAQQ-1：靶位点设计有哪些注意事项A-1：目前有几个在线设计软件，我们推荐使用ZhangFenglab：，该软件会对每一个潜在的靶位点打分，并告知是否存在脱靶现象。在设计Guide序列时，需要特别注意第一个碱基必须是G，如果您选取的Guide序列的第一个碱基不是G，需要自行加上一个G，因为这个G对于起始转录非常重要。Q-2：转染效率低，怎么办？A-2：因为Cas9蛋白比较大，就导致整个敲除质粒较大（8kb左右），如此大的质粒很容易导致转化效率低下，尤其是使用脂质体等化学试剂转染时，转染效率会比较低些。所以，我们推荐使用电转的方法进行转染。Bio-Rad的电转仪器需要根据不同的细胞单独配制转染buffer，所以不推荐使用；Life的Neon系统不错，但是因为耗材是镀金的，所以非常贵；而Genloci的CTX-1500A电转仪，转化效率高，不需要单独配制buffer，只需使用无血清的培养基就行，而且该电转仪的耗材也是相对比较便宜的。Q-3：单个细胞不生长，怎么办？A-3：对于单细胞不长的细胞进行敲除，首先建议采用共培养的方法看看能否促进单个细胞的生长。共培养可以采用培养过同种细胞的培养基培养单细胞；也可以使用CellPlazaTM（单细胞培养板），可以把细胞的存活率提高三倍以上。如果以上方法都不行，建议对细胞进行改造，加快其分裂速度，让单细胞可以很容易生长后，再对目的基因进行敲除。具体方法可以联系Genloci的客服做进一步的了解。Q-4：在做高通量样本时，如何才能快速筛选得到阳性克隆？A-4：建议使用错配酶进行筛选，可加快筛选的流程。目前市面上主要有三种错配酶：CruiserTM酶、T7EI和Surveyor酶。其中，CruiserTM酶和Surveyor酶属于CelI家族，这两种酶的筛选特异性比T7EI高。在酶切筛选过程中，T7E1的特异性较差，容易出现假阳性的结果，这在一定程度上阻碍了阳性克隆的筛选进度；Surveyor酶较贵，并且货期较长，所以我们推荐CruiserTM酶，它特异性高且价格合理。ProtocolNo.PT140726-1GenlociClassicCRISPR-Cas9内部操作流程VI．附录附录ApGK1.1linearVector以下为pGK1.1的插入位点示意图和质粒图谱，线性化pGK1.1所用的酶为BbsI。Figure3.pGK1.1插入位点图示Figure4.pGK1.1质粒图谱pGK1.1：GuideRNA：～20bpProtocolNo.PT140726-1GenlociBiotechnologiesInc.GenlociClassicCRISPR-Cas9内部操作流程VIICruiserTM操作说明1，操作步骤1）基因组DNA的准备提取细胞的基因组DNA，推荐使用Genloci公司专为阳性克隆筛选设计的TNA抽提试剂盒（Cat.No.:GL10851S），只需500个左右的细胞即可提取全基因组DNA，详细实验步骤请参看GenlociTNA抽提试剂盒（Cat.No.:GL10851S）说明书。2）杂交DNA的准备a)第一轮和第二轮（巢式）PCR引物设计分别设计FirstPrimers和NestedPrimers。其中FirstPrimers要求具有较高的特异性，其扩增产物推荐为500～1000bp，NestedPrimers推荐扩增产物长度为300～600bp。FirstPrimers和NestedPrimers引物对应目的序列的位置如下：模板DNA第一轮PCR产物第二轮（巢式）PCR产物1/32/3突变位点FirstPrimerNestedPrimerProtocolNo.PT140726-1GenlociBiotechnologiesInc.GenlociClassicCRISPR-Cas9内部操作流程b)第一轮PCR：获得目的片段将已经提取的基因组作为模板，使用FirstPrimers，以高保真DNA聚合酶扩增获得目的片段，要求目的片段明亮（允许少量杂条带，以及少量弥散）。同时获得野生型模板扩增产物和突变型模板扩增产物。推荐扩增循环数35～40cycles，反应体系25μl，100ng≤模板量≤300ng。PCR完成后，取7～8μl进行电泳检测。c)第二轮（巢式）PCR：获得杂交DNA根据第一轮PCR电泳检测中目的条带的亮度，用无菌去离子水稀释扩增产物（可参照Marker的亮度估算产物中DNA的浓度，稀释至总核酸浓度为10～20ng/μl，一般需要稀释10～50倍）。其中野生型模板扩增产物标记为：WTDNA；待检测的突变型模板扩增产物标记为：MTDNA；根据您的检测样本量的大小取合适量的稀释产物作为第二轮PCR的模板。小量样本的反应体系如下：MTDNA2.5μlWTDNA2.5μl5×NestedBuffer5μlMg2+Buffer1.5μldNTP（10mMeach）0.5μlNestedPrimer-F1.2μlNestedPrimer-R1.2μlGNestDNApolymerase0.3μlddH2O10.3μlTotalVolume25μl大量样本的反应体系如下：MTDNA1μlWTDNA1μl5×NestedBuffer2μlMg2+Buffer0.6μldNTP（10mMeach