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第5章家畜繁殖技术第六节精液保存和运输精液保存的意义1.精液经过保存后可以随时取用，实现异地配种，扩大配种数量，充分发挥优良公畜的配种效能，体现人工授精的优越性；2.可以延长精子在体外的存活时间；3.便于使用和运输。现行的精液保存方式有3种，即常温(15～25℃)保存、低温(0～5℃)保存和冷冻(-79～-196℃)保存。常温和低温保存是液态，故称液态保存。一、保存方法（一）精液的常温保存常温保存的温度在15～25℃之间，温度允许有一定变动，所以又称为变温保存或室温保存。常温保存所需设备简单，特别适合猪的精液。1.保存原理利用酸性环境抑制精子的活动，使其营养物质消耗减少，一旦PH恢复到7.0左右，精子还可以复苏，保持其受精能力。通过在稀释液中加入酸性物质，创造酸性环境，同时利用抗生素抑制微生物的繁殖，可以使精液保存一定时间。在一定范围内是可逆抑制，通常把pH调整到6.35左右。2.稀释液配方(见课本128页)（二）精液低温保存（保存温度0-5℃）1.保存原理精子在体温状态下，能够进行正常的代谢活动，随着温度的降低，精子的代谢活动减弱，当温度降至10℃以下时，精于的代谢活动受到抑制。营养物质消耗减少，代谢产物积累减缓，精子存活时间延长。但当温度回升，精子的代谢活动又逐渐恢复，并且不丧失受精能力，因此在低温下能延长精子的存活时间，故可达到保存目的。2.保存方法精液进行低温保存时，应采取逐步降温的方法，并使用含卵黄的稀释液，以防冷休克。把包装好的精液放到0～5℃的低温环境中，经1～2h，精液即降至0～5℃。在保存过程中，要维持温度的恒定，防止升温。3.低温保存稀释液见课本126页配方表。（三）精液冷冻保存精液冷冻保存是利用液氮(-196℃)或干冰(-79℃)作冷源；将精液经特殊处理后保存在超低温下，以达到长期保存的目的。精液冷冻保存是人工授精工作的一大进步，由于保存时间的延长，使精液的使用不受地区的限制，从而加快了家畜品种的育成和改良速度。1.精液冷冻保存的原理精子在超低温下，其代谢活动几乎停止（完全被抑制），使其在静止状态下保存下来，一旦升温又能复苏而不失去受精能力。其理论依据是玻璃化假说和甘油保护学说。（1）玻璃化假说物质的存在形式有气态、液态和固态，其中固态又分为结晶态和玻璃态。在不同的温度条件下，这两种形式可以相互转化。A.结晶态当精液的温度由冰点（0℃）缓慢降到-60℃左右时，精液中的水分由液态变成固态，冰晶颗粒大而均匀，叫做结晶态或冰晶化。对细胞内的细胞器构成巨大的破坏作用，因而，把这一温度区称为有害温区。缓慢降温形成冰晶化是造成精子死亡的主要原因。B.玻璃态但在特定冷冻剂参与下，精液由低温骤然降到-60℃度以下，精液变成固态时，冰晶颗粒细小而均匀，叫做玻璃态（化）。不会对细胞器造成破坏，从而达到长期保存的目的。经试验证明，在0～60℃是冰晶形成的温度区域，叫做危险温度区。而且在逐渐降温的条件下才能形成。降温越慢，冰晶形成越大，尤以-15～25℃为甚。玻璃化必须在-60～-250℃的低温区域内，经快速降温，迅速越过冰晶化而形成。(2)甘油保护学说快速降温可使精液跨越结晶态进入玻璃态，但急剧降温会造成精子冷休克。研究表明，向稀释液中添加甘油，不但可增强精子的抗冻能力，而且又可防止冰晶化和精子冷休克。甘油又名丙三醇，分子式CH2（OH）－CH2（OH）－CH2（OH），为高热能脂肪家族，其3个羟基（OH）为亲水基团，可与精液中的水结合，限制和干扰水分子的晶格排列，而产生冰晶；其烃链为疏水基团，朝向精子，可阻止精子的内外水分相互渗透，从而使精子保护在玻璃化膜中。但是，甘油浓度高时，对精子有危害作用，应掌握甘油的用量。一般牛冷冻精液中甘油通常加入5％～7％。除甘油外，其他多羟化合物如二甲基亚砜(DMSO)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、糖类等都具有抗冻作用。2.精液冷冻保存稀释液配方（见课本）3.冷冻精液制作方法牛的精液冷冻已普及，现以牛精液冷冻为例，将精液冷冻制作技术叙述如下：(1)采精及精液品质捡查精采精后，立即进行精液品质检查，制作冷冻精液的精子活率应达到0.7以上。(2)精液稀释根据冻精的种类、分装剂型和稀释倍数的不同，选择合适的稀释液，按照精液的稀释方法进行稀释。稀释后取样在38-40摄氏度下镜检活率不低于原精液。现生产中多采用一次或两次稀释法。3.降温平衡采用一次稀释法，由于稀释温度为30℃，需经1—2h缓慢降温至0-5℃，以防冷休克的发生。平衡是降温后，把稀释后的精液放置在0-5℃的环境中停留2-4h，使甘油充分渗入精于内部，起到膜内保护剂作用的过程。4.精液的分装现行冻精常采用颗粒、细管和袋装等分装方法。精液的分装(1)颗粒冻精将精液滴冻在经液氮致冷的金属网或塑料板上，冷冻后制成0．1m1左右的颗粒。颗粒冻精曾在牛中广泛应用，现多用于马、绵羊及野生动物的冻精剂型，具有成本低、制作方便等优点，但不易标记，解冻麻烦，易受污染。(2)细管冻精把平衡后的精液分装到塑料细管中，细管的一端塞有细线或棉花，其间放置少量聚乙烯醇粉(吸水后形成活塞)，另一端封口，冷冻后保存。细管的长度约13cm，容量有0.25、0.5或1.Oml。现生产中牛的冻精多用0.25m1剂型。细管冻精具有不受污染、容易标记、易贮存、适于机械化生产等特点，是最理想的剂型。(3)袋装冻精马和猪输精量大，可用塑料袋分装，但目前冷冻效果不理想。5.冻结(1)干冰埋植法适合于小规模生产及液氮缺乏地区。颗粒冷冻把干冰置于木盒中，铺平压实，用预先做好的模板在干冰上压出直径0.5cm、深2～3cm的小孔，用滴管将平衡后的精液0.1ml左右滴人孔内，覆以干冰，2～4min后，收集冻精保存。细管冻精冷冻将分装的冻精平铺于压实的干冰上，并迅速用于冰覆盖，2～4min取出贮存于干冰或液氮中。(2)液氮法颗粒冻精在广口液氮桶上安装铜纱网，调至距液氮面1～3cm，预冷几分钟后，使纱网附近温度达-80～-100℃，将精液均匀地滴压在铜纱网上，2～4min后，待精液颗粒充分冻结、颜色变浅发亮时，用小铲轻轻铲下颗粒冻精，每50～100粒装入纱布袋中，沉入液氮保存。细管冻精除按上述方法对细管进行熏蒸冷冻外，也可采用液氮浸泡法。把分装好的精液细管平铺于特制的细管架上，放人盛装液氮液氮柜中浸泡，盖好，5min后取出保存。这种方法启动温度低，冷冻效果好。（三）冻精的贮存目前，冻精保存普遍采用液氮做冷源，以液氮罐为容器贮存和分发冻精。1.液氮及其特性液氮是空气中的氮气经分离、压缩形成的一种无色、无味、无毒的液体，沸点温度为-195.8℃。在常温下，液氮沸腾，吸收空气中的水气形成白色烟雾。液氮具有很强的挥发性，当温度升至18℃时，其体积可膨胀680倍。此外，液氮又是不活泼的液体，渗透性差，无杀菌能力。基于液氮的上述特性，使用时要注意防止冻伤、喷溅、窒息等，用氮量大时要保持空气通畅，注意保护。2.液氮容器包括液氮贮运容器和冻精贮存容器，前者为贮藏和运输液氮用，后者为专门保存冻精用。当前冷冻精液专门使用的液氮罐型号较多，但其结构基本相同。(1)罐壁由内外两层构成，一般由坚硬的合金制成。(2)夹层指内外壳之间的空隙。为增加罐的保温性，抽成真空。真空度为1.33X10-4pa，在夹层中装有活性碳、硅胶及镀铝绦纶薄膜等，以吸收漏入夹层的空气，也增加了罐的绝热性。(3)罐颈由高热阻材料制成，是连接罐体和罐壁的部分，较为坚固。(4)罐塞由绝热性好的塑料制成，具有固定提筒手柄和防止掖氮过厦挥发的功能。(5)提筒存放冻精的装置。提筒的手柄由绝热性良好的塑料制成，既能防止温度向液氮传导，又能避免取冻精时冻伤。提筒的底部有多个小孔，以便液氮渗入其中。3.液氮容器使用应注意的问题液氮容器主要是靠真空和减少导热来维持其冷藏性能。使用时应注意：（1）用前仔细检查外观，看是否又碰伤；然后倒入液氮检查其损耗情况。（2）存放于阴凉、干燥、通风良好的室内，严禁靠近热源和室外日晒雨淋。（3）使用过程中尽量避免碰撞、振动，严禁横放、叠放或倒置。（4）存放液氮的容器要用瓶塞盖好，但瓶口不能密闭，以防爆炸。（5）存放精液等要定期补充液氮，确保冻精浸入液氮中。（6）取放冻精时，要尽量避免碰撞颈口。（7）液氮罐要定期清洗，以免污染冻精。随堂练习1.精液保存的意义。2.精液保存的方法及保存温度。3.精液冷冻保存的原理。