蔬菜农药残留快速检测技术(邵东农业局)

1蔬菜农药残留快速检测技术邵东农业局2第一节抽样•一、抽样的总体要求•(一)深刻认识抽样工作的重要性•科学的抽样，是监测工作的基础。蔬菜农药残留快速检测也是农产品质量安全监测的一种方式，一项内容，监测的具体技术工作也是始于抽样。•正确的抽样，是客观评价的前提。监测的目的既是为了反映成效也是为了发现问题，只有正确的抽样才能得到准确的结果去实现这样的目的。•规范的抽样，是可靠判定的保证。规范抽样是保证质量检验结果准确的前提。如果抽取的样品不具有代表性，那么检验的结果也不能代表整体的真实性，甚至有可能导致误判。3第一节抽样•一、抽样的总体要求•(二)认真把握抽样的基本原则•抽样的基本原则是随机性、代表性和真实性，在抽样过程中要认真把握好这三条原则。一是随机性。在确定抽样范围或区域后，要在其中随机抽取，不能随意按照被抽检方的安排和指示去抽取样品。二是代表性。应抽取混合样品，不能以单株(或单个果实)作为监测样品。抽取的样品，应能充分地代表产品的特征。三是真实性。抽取的鲜活样品应是成熟期或即将上市的产品，所抽样品均需经被抽单位或个人确认，基地抽样应做用药情况调查，超市抽样应调查进货渠道，抽样必须在规定时间内完成。4第一节抽样•一、抽样的总体要求•(三)扎实做好抽样前的准备工作•1、落实抽样实施方案•2、材料、器材准备•3、调研(如有必要)5第一节抽样•二、抽样实施细则•(一)抽样时间•1、生产基地•抽样应安排在蔬菜成熟即将上市前进行。•2、批发市场•一般在批发交易高峰期抽样。•3、农贸市场、超市•应在抽取批发市场样品前一天进行。6第一节抽样•二、抽样实施细则•(二)抽样方式•1、生产基地•(1)确定抽样单元•(2)抽样方法•2、批发、农贸市场和超市•在一个监测点抽取多个样品时，应尽可能从不同摊位抽取。同一样品应在同一摊位抽取。抽样按照五点取样法进行，即在整体样品的上、下、左、右、中等各个部位抽取样品。7第一节抽样•三、抽样量•一般每个样品抽样量不低于2.0kg，单个个体超过500g的抽取3—5个个体。8第一节抽样•四、记录•监测抽样必须做好详细的记录，抽样时由抽样人与被抽样单位共同完成抽样单的填写。抽样单一式三联，由抽样人员填写相关信息并签字，同时被检单位代表对填写信息进行签字确认。一联交被检单位，一联随同样品转运或由抽样人员带回承检单位，一联寄(交)抽检任务下达部门。9第一节抽样•五、样品制备•(一)样品制备场所•(二)制备工具和容器•(三)制备方法及要求10第一节抽样•六、样品储运与保存•抽样完成后，样品必须在24小时内送达实验室并完成检测。在样品运输过程中要保持样品的完好，运输工具要求清洁卫生，无污染，不混装有毒有害绚品，防止运输和装卸过程中可能造成的污染和损害。11第二节仪器原理•一、基本概念•分光光度计：就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器，是用不连续的波长采样反射物体或透射物体的一种测量仪器。由于不同物体分子的结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此，每种物体都具有特定的吸收光谱。能从含有各种波长的混合光中，将每一种单色光分离出来，并测量其强度的仪器。12第二节仪器原理•二、工作原理•蔬菜农药残留速测仪的工作原理即分光光度计的基本工作原理，是基于物质对光(对光的波长)的吸收具有选择性，不同的物质都有各自的吸收光带，所以，当光散射后的光谱通过某一溶液时。其中某些波长的光线就会被溶液吸收。在一定波长下，溶液中物质的浓度与光能量减弱的程度有一定的比例关系，即符合朗伯—比尔定律。13第二节仪器原理•三、组成结构•蔬菜农药残留速测仪(分光光度计)主要由光源、单色器、比色杯、检测器和显示器五大部分组成。•(一)光源•光源指一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的变化。蔬菜农药残留速测仪光源为钨灯，为固体光源结构，无需滤光片。14第二节仪器原理•三、组成结构•(二)单色器•将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分光系统或单色器。单色器可分成滤光片、棱镜和光栅。滤光片能让某一波长的光透过，而其它波长的光被吸收，滤光片可分成吸收滤光片、截止滤光片、复合滤光片和干涉滤光片。棱镜是用玻璃或石英材料制成的一种分光装置，其原理是利用光从一种介质进入另一种介质时，光的波长不同在棱镜内的传播速度不同，其折射率不同而将不同波长的光分开。光栅是分光光度计常用的一种分光装置，其特点是波长范围宽，可用于紫外、可见和近红外光区，而且分光能力强，光谱中各谱线的宽度均匀一致。•(三)比色杯•比色杯又称为吸收池或比色皿。比色杯常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成，用于盛放待比色溶液的一种装置。15第二节仪器原理•三、组成结构•(四)检测器•检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号放大的装置。常用的检测器为光电管和光电倍增管。•(五)显示器•显示器是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的装置。蔬菜农药残留速测仪主要用的是记录仪或数字显示器。可显示抑制率(％)和吸光值。16第二节仪器原理•四、技术参数•农药残留速测仪的主要技术参数如下：•波长：410nm(±2nm)；•透射比准确度：±0．5％T(0--100％T)；•重复性：±0．3％(A)；•抑制率显示范围：0---100％；•吸光度准确度与重复性：吸光度准确度：±0．5％吸光度重复性：±0．5％1•抑制率准确度：±8％抑制率重复性：3％；•电源：交流220V／50HZ直流9V。17第二节仪器原理•五、环境条件•蔬菜农药残留速测仪正常的使用范围为：1.环境温度5℃-35℃；2.室内相对湿度不大于85％；3．仪器应放在平稳的工作台上，无阳光直射及强烈的电磁场干扰；4．室内无腐蚀性气体。18第三节酶抑制法快速检测技术•一、酶抑制法农药残留快速检测原理•根据有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酶活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死，根据这一昆虫毒理学原理，而用在对农药残留的检测中。如果蔬菜的提取液中不含有有机磷和氨基甲酸酯类的农药残留或残留量较低，酶的活性就不会被抑制，试验中加入的基质就被酶水解或少部分水解，水解产物与加入的显色剂反应产生颜色。反之，如果蔬菜的提取液中含有一定量的有机磷或氨基甲酸酯类农药，酶的活性就被抑制，试验中加入的基质就不能被酶水解，从而不显色或颜色变化很小。用分光光度计来测定反应前后吸光值的变化，计算出抑制率，就可以判断蔬菜中含有机磷或氨基甲酸酯来农药的残毒情况。19第三节酶抑制法快速检测技术•二、胆碱酯酶的选择•方法中影响检测灵敏度最关键的试剂是胆碱酯酶，酶是一种生物活性物质，生化法中常用的酶是乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶，前者主要是从敏感家蝇头部提取纯化出来的，后者是从一种鱼的组织中提取纯化出来的。动物品系、酶被提取的程度、保存等都直接决定着酶的活性。20第三节酶抑制法快速检测技术•三、抑制时间及抑制温度丁酰胆碱酯酶对甲胺磷比较敏感，整体活性适中(△A为0．4-0．6)，抑制时间为15、20分钟时抑制率不稳定，且较低；30分钟时，抑制率较稳定，也比较高。抑制温度为25℃时，酶的活性要比38℃低一倍。因此本方法选择了丁酰胆碱酯酶，抑制温度为38℃，抑制时间为30分钟。21第三节酶抑制法快速检测技术•四、检测灵敏度，•(一)不同来源的胆碱酯酶活性及检测灵敏度•从不同动物组织中来源的酶对杀虫剂的敏感度是不同的，因此选择合适的酶源是酶抑制法检测中最关键的一步。目前牲速测中常用的酯酶多为乙酰胆碱酯酶(VehE)或丁酰胆碱酯酶(BehE)。乙酰胆碱酯酶主要分布在动物的神经系统和脊椎动物的红血球及肌肉中，在双翅目中(如家蝇)大部分酶活性集中在头部，约占总活性的65-90％。由于家蝇在实验室内培养饲养方便，选育敏感品系较容易，便于标准化饲养，所以大多数研究部门多以家蝇为做为敏感晶系的酶源。22第三节酶抑制法快速检测技术•四、检测灵敏度，•(二)同一酶源对不同品种农药的敏感度•不同品种的农药对同一种酶的抑制敏感度程度不同，即检测的灵敏度不同。由于酶抑制法检测结果受诸多因素影响，如受每批酶活性差异的影响、抑制温度、抑制时间、不同部位的样本提取液的杂质情况不同，操作误差等影响，使每次检测结果会有微小的误差。但如果操作中没有大的失误，经过重复试验后一般不会产生错误的结果。表一列出了对16中农药的灵敏度试验结果(丁酰胆碱酯酶)。•丁酰胆碱酯酶对以下农药不敏感，最低检出浓度均在30mg/kg以上，甲基对硫磷、水胺硫磷、甲基异柳磷、毒死蜱等。23第三节酶抑制法快速检测技术•五、检测方法•(一)主要仪器设备及试剂•l仪器设备：•2、试剂：•3、检测步骤•(1)试验前试剂准备•缓冲液：取一包一定比例的磷酸氢二钠INa2HP04·12H20)+磷酸二氢钾，加1000ml蒸馏水溶解，调pH至8。•酶：加3ml缓冲液溶解，放人冰块，保持低温，维持酶的活性。•显色剂：加10ml缓冲液溶解备用。•底物：加10ml缓冲液溶解备用。•(2)样品前处理．•取采集蔬菜样品，切碎，混合均匀。用电子天平称取2克样品(叶菜2克，果菜为4克)，称好样品放人专门的玻璃瓶中，加入20ml缓冲液，盖紧玻璃瓶，置于振荡器上振荡3分钟，取下玻璃瓶。准备好比色皿并编号，每个比色皿中，用50ul移液枪移取50ul酶，然后在1号比色皿中加入3ml缓冲液，剩下比色皿中依次用3ml移液枪从玻璃瓶中移取样品液3ml加人比色皿中；再用50ul移液枪移取50ul显色剂加入比色皿中，将比色皿盖好、摇匀，置于38℃恒温培养箱内放置30分钟。取出比色皿，用50u1移液枪移取50ul底物分别加入比色皿中，待测。(3)仪器测定•快速检测仪测定前，仪器先预热20分钟，调0、100正常后，开始检测，将比色皿按顺序放人仪器内，按空白键开始检测，若同一批样品不能一次检测，只需做一次空白，其余样品直接按样品键检测。•(4)结果处理•将检测所得抑制率数据，参照国家标准，抑制率≥70％，样品中存在有机磷或氨基甲酸酯类农药残留；抑制率≥50％--70％，样品中可能有有机磷或氨基甲酸酯类农药残留。此时应根据市场管理规定进行处理，或进一步用气相色谱等仪器进行定性定量分析。24第三节酶抑制法快速检测技术•六、技术要点•(一)实验室要求•以酶抑制法为检测技术的农药残留速测实验室，主要是为了满足基层监测机构及农产品生产、销售部门开展相关工作而建立，实验室应具备以下条件。•1、机构•2、人员．•3、管理•4、环境•5、检测设备配备率100％。25第三节酶抑制法快速检测技术•六、技术要点•(二)技术关键点•1、实验室环境条件•主要是要保持实验室环境温湿度，防止由于天气过冷或过热对酶试剂的影响。•2、药剂保存•主要是酶要保存在—18℃以下低温冰箱内，防止因为酶失去活性影响检测。•3、移液枪定量操作技术•主要是能够准确熟练的使用移液枪完成定量操作，避免由于移取试液量的误差导致最终结果的误差。．•4、反应速度的控制•主要是最后加入底物后反应立刻进行，要迅速匀速将样品放人仪器测定，避免因为样品在室外反应后再测定，影响测定结果。•5、异常数据的处理。•出现异常数据，首先是分析原因，重做样品进行问题确认，再做下一步的处理。26第三节酶抑制法快速检测技术•六、技术要点•(三)方法局限性•l此方法适用于新鲜蔬菜和水果上的农残快速检测，但部分含特殊物质(s)的蔬菜如大葱，大蒜、韭菜等以及一些菌类如茭白、蘑菇等，易得出现假阳性结果。对含残留量愈高的蔬菜，测定的误差愈小。此法也不适于茶叶等干样样品。•2、此方法只能检测有机磷和氨基甲酸酯类农药，不适用于其他农药残毒检测，且不能定性和定量，所以，当用此方法检测出有残毒问题的蔬菜时，如果要作为仲裁处理，应送到有关部门进一步用气相色谱等仪器进行定性和定量分析，其结果方可作为最终结论性数据。•3、在有机磷和氨基甲酸酯类农药中，也有少部分农药品种对此方法不够灵敏(检出浓度3