蔬菜农药残留快速检测技术

蔬菜农药残留快速检测技术主要内容•第一节农药概述•第二节蔬菜农药残留检测的方法第一节农药概述•一、农药的概念农药(pesticides)是指用于防治危害农作物及农副产品病虫害、杂草及其他有害生物的药物总称。现在农药不仅应用于农业，而且也广泛应用于畜牧业、林业和公共卫生事业等方面•二、农药的分类（一）.按化学成分可分为有机氯、有机磷、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类及砷、汞、铜、硫磺等制剂。（二）.按用途可分为杀虫剂、杀菌剂、除草剂、植物生长调节剂和粮食熏蒸剂等。•三、农药的作用•农药在防治农作物病虫害和杂草、提高农业产量方面具有显著的效果。•农药与人、动物的健康有着密切的关系。农药的使用，杀灭了一些病原及传播媒介，使某些疾病得到了控制，在一定程度上提高了人类的健康水平。提高农畜产品的产量和质量等方面，起着重要的作用。•四、国家限用、禁用的农药•（一）、国家明令禁止使用的农药•农业部第199号公告，从2002年6月5日起禁止使用下列农药：六六六（HCH），滴滴涕（DDT），毒杀芬，二溴氯丙烷，杀虫脒，二溴乙烷(EDB)，除草醚，艾氏剂,狄氏剂，汞制剂，砷、铅类，敌枯双，氟乙酰胺，甘氟，毒鼠强，氟乙酸钠，毒鼠硅。•根据农业部第322号公告，从2007年6月1日起，禁止下列农药在农业上使用：甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷和磷胺。•（二）、限制使用的农药•根据农业部第194号公告禁止氧乐果在甘蓝上使用，甲基异硫磷在果树上，涕灭威在苹果树上，克百威在柑桔树上，甲拌磷在柑桔树上，特丁硫磷在甘蔗上使用。•根据农业部第199号公告，从2002年6月5日起，禁止甲拌磷，甲基异柳磷，特丁硫磷，甲基硫环磷，治螟磷，内吸磷，克百威，涕灭威，灭线磷，硫环磷，蝇毒磷，地虫硫磷，氯唑磷，苯线磷在蔬菜、果树、茶叶、中草药材上使用，禁止三氯杀螨醇和氰戊菊酯在茶树上使用。•根据农业部第274号公告，从2003年6月1日起，禁止丁酰肼（比久）在花生上使用。第二节蔬菜农药残留检测的方法•一、农药残留的概念•农药残留(pesticideresidues)是指农药施用后，残存在生物体、农副产品和环境中的微量农药原体、有毒代谢产物、降解物和杂质的总称。残留的数量叫残留量。•二、农药残留检测的方法•（一）速测卡法（纸片法，GB/T5009.199—2002）•（二）酶抑制法（GB/T5009.199-2002、NY/T448-2001）速测卡法（纸片法，GB/T5009.199—2002）•一、原理•二、检测对象：有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药以及这两类农药的有毒代谢产物。速测卡法（纸片法，GB/T5009.199—2002）速测卡法（纸片法，GB/T5009.199—2002）三、试剂•1、速测卡：固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片。•2、洗脱液（pH7.5缓冲溶液）：取15.0g磷酸氢二钠[Na2HPO4·12H2O]与1.59g无水磷酸二氢钾[KH2PO4]，用500mL蒸馏水溶解。四、仪器•1、常量天平•2、37℃±2℃恒温装置（恒温培养箱或恒温水浴锅）速测卡法（纸片法，GB/T5009.199—2002）•五、方法步骤•方法一：整体测定法1、选取有代表性的蔬菜样品，檫去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取5g放入带盖瓶中，加入10mL缓冲溶液，振摇50次，静置2min以上。2、取一片速测卡，用白色药片沾取提取液，放置10min以上进行预反应，有条件时在37℃恒温装置中放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。3、将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片迭合发生反应。4、每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。速测卡法（纸片法，GB/T5009.199—2002）•方法二：表面测定法（粗筛法）1、檫去蔬菜表面泥土，滴2～3滴缓冲溶液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。2、取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上。3、放置10min以上进行预反应，有条件时在37℃恒温装置中放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。4、将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片迭合发生反应。5、每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。速测卡法（纸片法，GB/T5009.199—2002）•六、结果判定：检测结果以酶被有机磷或氨基甲酸酯类农药抑制（阳性）、未抑制（阴性）表示，具体见下表：速测卡法（纸片法，GB/T5009.199—2002）•阳性结果•阴性结果速测卡法（纸片法，GB/T5009.199—2002）•七、部分常见农药的检出限及最大残留限量（单位：mg/kg）农药名称检出限残留限量农药名称检出限残留限量甲胺磷1.7不得检出敌敌畏0.30.2对硫磷1.7不得检出敌百虫0.30.1水胺硫磷3.1不得检出乐果1.31.0马拉硫磷2.0不得检出西维因2.52.0久效磷2.5不得检出好年冬1.0不得检出乙酰甲胺磷3.50.2呋喃丹0.5不得检出速测卡法（纸片法，GB/T5009.199—2002）•八、速测卡法的使用注意事项•（一）葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整株（体）蔬菜浸提或采用表面测定法。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提的方法，减少色素的干扰。•（二）当温度条件低于37℃，酶反应的速度随之放慢，药片加液后放置反应的时间应相对延长，延长时间的确定，应以空白对照卡用（体温）手指捏3min时可以变蓝，即可往下操作。注意样品速测卡法（纸片法，GB/T5009.199—2002）放置的时间应与空白对照卡放置的时间一致才有可比性。空白对照卡不变色的原因：一是药片表面缓冲溶液加得过少、预反应后的药片表面不够湿润，二是温度太低。（三）速测卡对农药非常敏感，测定时如果附近喷洒农药或使用卫生杀虫剂，以及操作者和器具沾有微量农药，都会造成对照和测定药片不变蓝。（四）红色药片与白色药片叠合反应时间以3min为准，3min后的蓝色会逐渐加深，24h后颜色会逐渐褪去。酶抑制法（GB/T5009.199-2002、NY/T448-2001）一、原理在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。酶抑制法（GB/T5009.199-2002、NY/T448-2001）•原理示意图：酶抑制法（GB/T5009.199-2002、NY/T448-2001）•二、试剂的配置及保存•（一）提取试剂•配制：使用时每袋提取试剂用1000ml蒸馏水溶解。•保存：固体及溶解后的提取试剂均在常温下保存。•（二）专用酶•配制：使用时每支酶粉用10ml提取试剂溶解。•保存：粉状的酶应储存在冷冻室内（约-18℃），用时用提取试剂溶解，溶解后的酶液分成2-4小瓶，暂时不用的储存在冷冻室内，用时解冻，用后的酶液储存在冷藏室（0-5℃）内，在一周内用酶抑制法（GB/T5009.199-2002、NY/T448-2001）•完，酶液反复解冻最多不能超多两次，否则会影响酶的活性。•（三）底物•配制：使用时每瓶底物用10ml提取试剂溶解。•保存：固体及溶解后的底物均应保存在冰箱的冷藏室内（0-5℃）。•（四）显色剂•配制：使用时每瓶显色剂用10ml提取试剂溶解。•保存：固体及溶解后的底物均应保存在冰箱的冷藏室内（0-5℃）。酶抑制法（GB/T5009.199-2002、NY/T448-2001）•三、农残速测实验室仪器配置•仪器名称数量•1、RP-410农药残毒快速检测仪1•2、台式恒温培养箱1•3、微型样本混合器1•4、电子天平（精确度0.1g）1•5、移液枪及其配套管嘴•可调移液枪40-200ul1•1-5ml1酶抑制法（GB/T5009.199-2002、NY/T448-2001）•管嘴40-200ul100•1-5ml25•96孔60型管嘴盒1•6、其他小零件及玻璃仪器•定量加液器（20ml）*2、定时钟*2、取样器*2、提取瓶*20、玻璃棒*2、镊子*2、洗瓶*2、储液瓶（1000ml）*2、试管*20、平底小试管*20、量筒（500、20ml）各两个、烧杯（100、250、500、1000ml）各两个、橡胶垫*2、移液管（10、20m）各一支、容量瓶（1000ml）*1、大试管架*1、小试管架*1、标准口三角瓶*2、小试剂瓶*5，还有清洁刷、洗耳球、滤纸、蒸馏水瓶、记号笔、丝绸抹布等。酶抑制法（GB/T5009.199-2002、NY/T448-2001）•7、配套试剂•酶（7支）、底物（5瓶）、显色剂（瓶）、提取试剂（20包）可检测1125个样本。•8、配套设施•冰箱、电热蒸馏水器、大理石工作台、仪器柜、写字台、垃圾桶等。酶抑制法（GB/T5009.199-2002、NY/T448-2001）•四、检测范围及灵敏度•（一）蔬菜：叶菜、果菜、豆菜、瓜菜（除胡萝卜、韭菜、茭白、蘑菇等）•（二）农药•1、有机磷类：•甲胺磷、对硫磷、氧化乐果、甲拌磷、久效磷、敌敌畏、杀扑磷等（灵敏度0.5-5㎎/㎏）•甲基对硫磷、水胺硫磷、甲基异柳磷、毒死蜱、乐果等（灵敏度8-10㎎/㎏）酶抑制法（GB/T5009.199-2002、NY/T448-2001）•2、氨基甲酸酯类：•克百威、涕灭威、灭多威、丙硫克百威、丁硫克百威、抗蚜威、仲丁威、苏灭威、残杀威、西维因、叶蝉散（灵敏度0.2-2.5㎎/㎏）。•注：葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整株(体)蔬菜浸提。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株(体)蔬菜浸提的方法，减少色素的干扰。酶抑制法（GB/T5009.199-2002、NY/T448-2001）•五、采样•（一）采样原则：对每一货批按5点抽样法随机取样，将样品缩分后抽取2kg，取1kg样品作为备样，备样应低温保存。酶抑制法（GB/T5009.199-2002、NY/T448-2001）•（二）采集对象：•1、蔬菜基地：上市前的蔬菜•2、市场：正在售卖的蔬菜样品名称检测部位番茄、茄子去蒂供测黄瓜去果柄供测萝卜、胡萝卜叶、根（用水轻轻洗去根泥、稍晾干）分别供测大白菜、小白菜去根、去外测腐叶、供测酶抑制法（GB/T5009.199-2002、NY/T448-2001）•六、检测步骤•1、取采集蔬菜样品，切碎，混合均匀。•2、用电子天平称取2克样品(叶菜2克，果菜为4克)，称好样品放人专门的提取瓶中，加入20ml提取试剂，盖紧提取瓶，置于振荡器上振荡3分钟，取下提取瓶，静置3-5分钟。•3、准备好比色皿并编号，每个比色皿中，用50ul移液枪移取50ul酶，然后在1号比色皿中加入3ml样本提取液，剩下比色皿中依次用3ml移液枪从提酶抑制法（GB/T5009.199-2002、NY/T448-2001）•取瓶中移取样品液3ml加人比色皿中；再用50ul移液枪移取50ul显色剂加入比色皿中，将比色皿盖好、摇匀，置于38℃恒温培养箱内放置30分钟。•4、取出比色皿，用50u1移液枪移取50ul底物分别加入比色皿中，待测。•5、快速检测仪测定前，仪器先预热20分钟，调0、100正常后，开始检测，将比色皿按顺序放人仪器内，按空白键开始检测，若同一批样品不能一次检测，只需做一次空白，其余样品直接按样品键检测。酶抑制法（GB/T5009.199-2002、NY/T448-2001）•6、检测结果计算公式••抑制率（％）=(△Ac-△As)/△Ac×100％•△Ac：对照组3分钟后与3分钟前吸光值之差•△As：样本3分钟后与3分钟前吸光值之差•注：对照组的比色皿中用3ml提取试剂代替样本提取液酶抑制法（